リポ多糖類注射によるゼブラフィッシュ幼生の神経炎症誘発

要約

出典:He, Y. et al.神経炎症と神経毒性を評価するためのゼブラフィッシュ幼虫へのリポ多糖類の脳室マイクロインジェクション。J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオは、ゼブラフィッシュの幼生の脳にリポ多糖類(LPS)を微量注入して神経炎症を誘発する方法を示しています。幼虫をアガロースで裏打ちされた皿の上に置き、針を脳室に挿入し、LPSを注入します。注入されたLPSは、神経炎症を引き起こす免疫反応を引き起こします。

プロトコル

1. マイクロインジェクションの準備

1. マイクロピペットプーラー(材料の表を参照)を使用してガラスキャピラリーを引っ張り、ガラスキャピラリーチューブの引っ張りの5段階のプロトコル(表1)に従って注入の準備
をします。
2. 針の先端(フィラメント付き薄肉ガラス毛細管[3.5インチ]、外径[OD]1.14 mm)を鉗子を使用して斜めに適切なサイズに開きます(図1A)。
3. 針に0.1mLの鉱油を入れて、気泡が入らないことを確認します。
4. マイクロインジェクション装置のスチールニードルのスクリューキャップを取り外します。.ガラス針の穴をスチール針に合わせ、ネジキャップを締めます。装填したニードルマイクロインジェクション装置をマイクロマニピュレーターに取り付けます(材料表を参照)。
5. マイクロマニピュレーターが顕微鏡下で装置を柔軟に動かせるように、マイクロインジェクション装置の位置を調整してください。一定量のパラフィンオイルを排出して、スチールニードルをキャピラリーガラスチューブに挿入させます。
6. 70%エタノールで滅菌したスライドガラス上に注射液(1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)や5 mg / mL LPSなど)を落とし、先端が液滴に挿入されるようにマイクロインジェクション装置を調整します。.~2 μL の注射液を針にロードします。
7. マイクロマニピュレーターをセット(上下左右の微調整設定)して、マイクロインジェクション装置の針先が高倍率で幼虫と同じ視界に入るようにします(図1B)。

>2. ゼブラフィッシュのマイクロインジェクション用マウント

>注:ゼブラフィッシュの脳の発達は、受精後3日以内に起こり(dpf)、よく発達した中枢神経系とともに5dpfで成熟します。したがって、5 dpfの幼虫は、LPSを介したニューロンの損傷だけでなく、行動反応や炎症反応の研究にもすでに適しています。

1. ゼブラフィッシュの幼生は、目的の段階に到達してから約30分以内に注入し、注入タイミングの一貫性を維持します。
2. ゼブラフィッシュの幼生に麻酔をかけるには、トリカインをきれいな水槽の水(最終濃度0.02%w / vトリカイン)と組み合わせます。
3. マイクロ波を使用して、2%アガロースの溶液を二重蒸留水(ddH₂O)で溶解します。溶かしたアガロースをプラスチック皿に注ぎます。2%アガロースコーティングされたプラスチックディッシュは、4°Cで最大2週間保存できます。
4. プラスチック製の移送ピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を2%アガロースコーティングされたプラスチック皿の中央に輸送します。針にアクセスできるように、マウントされた幼虫の脳側を上にして向きを変えます。

3. 脳室への注射

1. ゼブラフィッシュの脳室構造が視野にはっきりと見えるように、顕微鏡の倍率を調整します(図1B)。
2. 針を脳蓋の上に慎重に置きます(図1C)。
3. ゼブラフィッシュの脳の皮膚を針先でマイクロマニピュレーターを使ってゆっくりと穿刺します。
4. フットペダルを踏むと、1 nLの1x PBSまたはさまざまな濃度のLPS(1.0、2.5、5.0 mg / mL)が排出されます(材料の表を参照)。例として、脳室に1nLの1%エバンスブルー色素(PBSで希釈)を脳室に注入した成功した心室注射画像を示します(図1D)。注射後すぐに幼虫をきれいな卵水(E3)培地に移します。24時間後、顕微鏡イメージング、ロコモティブ行動アッセイ、およびその他の指標の決定のために幼虫を採取します。

結果

>表1:ガラス毛細管引っ張りの5ステッププロトコル。

の の ...

歩	動作時間(秒)	熱レベル	アクション
T1	L>	H80-89	P1L005
T2	1.6-3	H00
T3	L>	H00	P2L001cの

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A6361 (英語
アガロース、低ゲル化温度	シグマ・アルドリッチ	A9414の
Drummond Nanoject III プログラマブル ナノリットル インジェクター	ドラモンドサイエンティフィック	3-000-207
蛍光実体顕微鏡	ライカ	M205 FA
大腸菌O111:B4由来のリポ多糖	シグマ・アルドリッチ	L3024
手動式マイクロマニピュレーター	世界の精密機器	M3301
鉱油	シグマ・アルドリッチ	M5904
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	P4417
薄肉ガラスキャピラリー(4インチ)、フィラメント付き、外径1.5 mm	世界の精密機器	TW150F-4
トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルエステル)	シグマ・アルドリッチ	A-5040

) シリーズ の 型