マウス小脳顆粒ニューロンにおける活性酸素種誘発性ニューロン死のモデル化

1. 実験の準備

>注:次のストック溶液は、使用するまで調製および保守できます。

1. 解剖ソリューション
   1. 3.62gの塩化ナトリウム(NaCl)、0.2gの塩化カリウム(KCl)、0.069gのリン酸ナトリウム(NaH₂PO₄・H₂O)、および1.306gのD-(+)-グルコースを500mLの蒸留H₂Oに溶解します。次に、12.5 mLのHEPESバッファー、450 μLのフェノールレッド溶液、および20 mLのウシ血清アルブミン(BSA)フラクションVを溶液に加えます。1 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を使用してpH 7.4に調整します。
   2. 0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。このソリューションは、最大1週間から10日間安定しています。
2. トリプシン
   1. 0.9%塩化ナトリウム中の25 g/Lのトリプシン濃度の原液を調製します。溶液は-20°Cで保存してください。
3. トリプシン阻害剤
   1. 1 gの鶏卵白トリプシン阻害剤を1 mLの1 mM HClに溶解して、10 mg/mLの濃度のストックを調製し、この溶液を-20°Cで保存します。
4. デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)
   1. 100 mgのDNase 1を10 mLの滅菌水に溶解して、10 mg/mLのストックを生成します。溶液は-20°Cで保存してください。
5. MgSO4
   1. 50 mLの蒸留水(H₂O)に6.02 gの硫酸マグネシウム(MgSO₄)を加えて、1 Mストックを生成します。溶液は4°Cで保存します。
6. CaCl₂
   1. 0.735 gの塩化カルシウム(CaCl₂∙ 2H₂O)を50 mLの蒸留H₂Oに100 mMのストック濃度で溶解します。溶液は4°Cで保存してください。
7. KClの
   1. 3.7275 gのKClを50 mLの蒸留H₂Oに溶解し、ストック濃度1 Mにします。
8. D-(+)-グルコース
   1. 1.802gのD-(+)-グルコースを蒸留H2O50mLに溶解し、ストック濃度100mMにします。溶液は4°Cで保存してください。
9. 細胞培養培地
   1. 5 mLの熱不活化透析ウシ胎児血清、500 μLの200 mM L-グルタミン、100 μLの50 mg / mLゲンタマイシン、および1.0 M KCLの1 mLを、1.125 g / L D-グルコースを補充して50 mLの小脳顆粒ニューロン(CGN)培養培地を生成するために、45 mLのフィルター滅菌Eagleの最小必須培地(E-MEM)に追加する必要があります。メディアは4°Cで保存してください。
10. シトシンβ-D-アラビーノフラノシド
    1. 48 mgのシトシンβ-D-アラビノフラノシドを10 mLの成長培地に溶解し、ストック濃度を20 mMにします。溶液は-20°Cで保存してください。
11. ポリ-D-リジン
    1. 2 mg/mL のポリ D-リジンストックを生成するには、10 mL の滅菌 H₂O を 20 mg のポリ D-リジンに加えます。ストックポリD-リジンは、-80°Cで100μLアリコートで保存する必要があります
       手記： 以下の溶液は、解剖前に調製し、使用するまで4°Cに維持する必要があります。
12. MgSO₄ 添加解剖液
    1. 300 μL のストック MgSO₄ から 250 mL の解剖液を添加します。
13. トリプシン解剖液
    1. 100 μLのストックトリプシンと12 μLのストックMgSO₄〜10 mLの解剖液を加えます。
14. トリプシン阻害剤溶液1
    1. 164 μLのストックトリプシン阻害剤、250 μLのストックDNase 1、12 μLのストックMgSO₄ to 10 mLの解剖液を添加します。
15. トリプシン阻害剤溶液2
    1. 1040 μLのストックトリプシン阻害剤、750 μLのストックDNase 1、および12 μLのストックMgSO₄〜10 mLの解剖液を添加します。
16. CaCl₂ 添加解剖液
    1. 10 μL の CaCl₂ ストックと 25 μL の MgSO₄ ストックを 10 mL の解剖液に加えます。
17. ポリD-リジンコーティング培養皿
    1. 培養皿をコーティングするには、100 μL のストックポリ D-リジンを 40 mL の滅菌 H₂O で希釈します。35 mmのNunc培養ディッシュには、希釈したポリD-リジン溶液2 mLを加えます。4ウェルプレートの場合、各ウェルに300 μLの希釈ポリD-リジンを加えます。
    2. ポリD-リジンを1時間放置してから、滅菌H₂Oを4 mLまたは600 μL(それぞれ35 mm培養皿または4ウェルプレート)で吸引し、各ウェルを洗浄します。次に、H₂Oを吸引し、皿を1時間風乾させます。

2. 脳の抽出と小脳の分離

1. 生後6〜7日のマウスの子犬を斬首ハサミで斬首します。無菌組織培養フードで脳の解剖を行います。
2. 脳を切除するには、一対の鉗子を使用して頭をつかみ、図1に示すように、マイクロダイセクションハサミを使用して頭の前方に向かって皮膚を切り込みます。次に、新しいハサミを使用して頭蓋骨を切断し、汚染のリスクを最小限に抑えます。鉗子を使用して脳を覆っている頭蓋骨を取り除き、鉗子またはヘラを使用して脳を引き出します。
   1. 必要に応じて、視神経を切断して、脳全体を外に出しやすくします。
3. 脳を解剖液に入れ、MgSO₄を補充します。溶液と脳を氷の上に保ちます。
4. 脳を切除した後、解剖顕微鏡下で、MgSO₄ を添加した解剖液中に脳から小脳を解剖し、細い鉗子を使用して髄膜を切除します。小脳を腹側に向け、脈絡叢の除去を確実にします。
5. 小脳を ~1 mL の MgSO₄ 添加解剖液を含む 35 mm 皿にプールします。
6. 組織を細かく刻み、30 mLのMgSO₄緩衝解剖液を含む50 mLチューブに移します。

3. マウス小脳顆粒ニューロンの単離と培養

1. 刻んだ脳組織を含む50 mLチューブを、644 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
2. 上清を取り除き、10 mLのトリプシン解剖液を追加します。.次に、チューブを37°Cで15分間高速で振とうします。
3. 10 mLのトリプシン阻害剤溶液1をチューブに加え、2分間静かに振とうします。
4. チューブを644 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清を取り除き、2 mLのトリプシン阻害剤溶液2を加え、15 mLのチューブに移します。.
6. 溶液が濁るまで、15mLチューブ内の組織を粉砕します。その後、5分間落ち着かせます。
7. 透明な上清を取り除き、上清を1mLのCaCl₂添加解剖液を含む新しいチューブに移します。
8. ステップ3.6のペレットが入ったチューブの底に、別のmLのトリプシン阻害剤溶液2を追加します。.再び回転させ、5分間落ち着かせます。上清を取り除き、ステップ3.7の上清を含むチューブに追加します(つまり、ステップ3.6〜3.7を繰り返します)。ほとんどの組織が機械的に解離するまで、このプロセスを繰り返します。
9. 上清1mLごとに、0.3mLのCaCl₂添加解剖液を上清コレクションに加えます。
10. チューブの内容物を混合し、644 x gで5分間遠心分離します。
11. 上清を取り除き、ペレットに10mLの新鮮な培地を加えて混合します。
12. その後、細胞をカウントし、1.5 x 10⁶細胞/mLの濃度に希釈することができます。一般に、解剖された各脳から1,000万個の細胞が予想され、トリプシン化時間と解剖の効率に依存することに注意してください。以前に作成したポリD-リジンプレート上のプレートセル。4ウェルプレートの場合、0.5 mLをプレート化し、ウェルあたり7.5 x 10⁵細胞を与えます。35 mmの皿の場合、4 mLをプレートに取り、プレートごとに6 x 10⁶細胞を与えます。
13. 24時間後、シトシン-β-アラビノフラノシド(AraC)をプレートに追加して、グリア汚染を減らします。培地1mLにつき、0.5 μLの20 mM AraCが必要です。AraCの追加には、メディアの変更は必要ありません。細胞を7〜8日間維持する場合は、3日目にこの処理を繰り返します。
14. 5% CO₂インキュベーターで37°Cの培養物を維持し、過去5日間は2日間ごとに培地2 mLごとに100 μLの100 mMグルコースを培養物に添加して給餌します。メディアを完全に交換する必要はありません。

4. 神経損傷のモデル化

1. ROS誘発性細胞死(酸化ストレス)を誘導するには、ニューロンを75〜100μMの過酸化水素(H₂O₂)で処理し、H₂O₂に5分間曝露した後、並行培養から馴化培地に切り替えます。H₂O₂ は不安定であるため、24 時間の処理後に培養中の細胞死が 50 〜 70% 誘発されるレベルまで濃度を最適化してください (図 2)。

図1:マウスの脳の除去と小脳の解剖 (A)生後6-7日齢のマウスの脳を抽出するには、一対の鉗子を使用して、頭をつかみ、一対のマイクロダイセクションハサミを使用して点線に沿って皮膚を前方に切断します。皮膚と結合組織だけを切るように注意してください、切開が深すぎると頭蓋骨に穴が開いて脳に損傷を与える可能性があります。これらの3つの切開部は、正中線に沿ってまっすぐに、2つは横方向に湾曲しているため、皮膚を押し戻して頭蓋骨を露出させることができます。露出したら、ハサミの先端で頭蓋骨を貫通し、前方に切断することができます。髄膜の特定と除去を容易にするために、小脳を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。切断後、鉗子を使用して頭蓋骨を剥がし、脳を露出させ、その後、一対の鉗子またはへらを使用して冷たい解剖液に引き出すことができます。脳を切除するためには、視神経を切断する必要があるかもしれません。(B)頭蓋骨から取り除いたら、髄膜は一対の細い先端の鉗子を使用して小脳から取り除く必要があります。(C)一対の細い先端の鉗子を使用して、小脳を残りの組織から解剖し、髄膜の完全な除去を確認するために検査します。

図2:小脳顆粒ニューロンにおけるニューロン損傷のモデル化。 6〜7日目のマウスから単離された小脳は、パート3で提示された手順に従って単一細胞に解離されます。解離後、細胞をカウントし、1.5 x 106細胞/mLを生成するために、培養培地の体積に再懸濁されます。For 35 mm皿の場合、4 mLをプレーティングし、プレートあたり6 x 106細胞を与えます。イメージングスライドの場合、0.5 mLを播種し、7.5 x 105細胞/ウェルが得られます。その後、CGNはレンチウイルスで形質導入するか、アデノウイルスに感染させることができます。めっき当日(0日間in vitro(DIV))にアデノウイルスを使用すると、90%を超えるトランスフェクション効率が得られ、酸化ストレスやDNA損傷による神経損傷の研究が可能になります。10 μMのカンプトテシン(CPT)の添加はDNA損傷を誘発し、75〜100 μMの過酸化水素(H2O2)は酸化ストレスを誘発します。H2O2の濃度は、24時間後に50%の細胞死を誘導するために最適化する必要があります。5 DIVでアデノウイルスに感染すると、形質導入効率が10%未満低下します。7 DIVでNMDA受容体が培養物中に濃縮されると、ニューロンを100 μM NMDAおよび10 μMグリシンで処理して興奮毒性を誘導できます。これは、その後のイメージング解析や単一のニューロンの追跡に最適です。最後に、0 DIVでレンチウイルスを形質導入し、続いて7 DIVで100 μM NMDAおよび10 μMグリシンで処理すると、ChIPシーケンシング、タンパク質発現の検査、生死アッセイの実施など、培養の生化学的分析を可能にするのに十分な形質導入効率(>80%)が得られます。