マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

要約

出典:Quintanilla, L. J., et al.成体海馬神経前駆細胞の回路特異的な調節を評価。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫組織化学

1. チミジンアナログ染色
   1. 組織切片をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に置き、正に帯電したスライドに5-8切片をマウントし、前方から後方への連続的な順序を維持し、同じ向きを維持します。ティッシュ切片を乾かしてスライドに完全に密着させ、疎水性ペンまたはPAPペンを使用して境界線を引きます。
   2. 透過処理バッファー(0.5% TBS(トリス緩衝生理食塩水)-トリトン)で切片を20〜30分間透過処理します。次に、TBS-tritonを使用して切片を2回、各5分間洗浄します.
      注:透過処理は、細胞内抗体の浸透を助けます。透過化時間は、組織の厚さと抗体効率に応じて調整できます。あるいは、界面活性剤の濃度を上げて透過化の効力を高めることもできます。ただし、透過化時間が長くなると組織の脆弱性が増すため、透過化が長くなりすぎないように注意する必要があります。
   3. 表1に従ってEdu(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)反応溶液を調製します。Alexa488-アジドの最終濃度は、1 mLのEdu反応溶液中で15 μMです。
   4. 切片をEdu反応溶液中で30分から1時間インキュベートした後、TBS-トリトンで3回、各5分間洗浄します。このステップの後、アルミホイルでスライドさせてカバーし、光から保護します。この段階で、蛍光顕微鏡を使用してEdu反応が機能するかどうかを確認します。Edu標識細胞は、落射蛍光顕微鏡下で蛍光を発します。
2. マウントされた組織切片のプロトコル
   1. ステップ1.1.4のスライドにマウントした組織切片を、二次抗体と同じ動物(例:ロバ血清)で育てたブロッキングバッファーを使用して30分から1時間ブロックし、次いでTBS-tritonで2回、それぞれ5分間洗浄します。
   2. ブロッキングステップ中に一次抗体(すなわち、チキン抗ネスチン)溶液を調製するには、ブロッキングバッファー溶液に一次抗体を1:200で混合します。スライドあたり250 μLで、組織が溶液に完全に浸漬されることを確実にするには十分です。
   3. ブロッキング洗浄後、一次抗体溶液中の組織切片をRTで一晩インキュベートします。使用する一次抗体に応じてこのステップを修正します.
      手記： 抗体のバックグラウンド結合や非特異的結合が高い場合は、室温ではなく4°Cでインキュベートすると結果が向上する可能性があります。組織への浸透性が低い抗体は、必要に応じて2日間インキュベートすることができます。
   4. 組織切片をTBS-tritonで3回インキュベートし、5分間インキュベートして、余分な一次抗体を除去します。次に、ブロッキング緩衝液中で調製した蛍光色素標識二次抗体(例:Alexa 647 anti-chicken at 1:200)で組織切片をインキュベートし、室温で2時間
   。
   5. 組織切片をTBS-tritonで5分間3回インキュベートして余分な二次抗体を除去し、300 μM DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液をPBS中1:100で室温で15分間適用します。
   6. 組織切片をPBSで3回インキュベートし、5分間インキュベートして余分なDAPIを除去し、綿棒または繊細なタスクワイプを使用して組織の周囲からパップペンサークルを取り除きます。切片を乾かしてから、封入剤とカバースリップを塗布します。イメージングスライドの前に、封入剤を乾かしてください。

>表1:免疫組織化学に利用される溶液

)

不凍液	エチレングリコール150mL+スクロース150g+500mL00mL0.1M PBで500mL溶液に充填
クエン酸バッファー	9 mL のクエン酸ストック + 41 mL のクエン酸三ナトリウム緩衝液 + 450 mL の ddH2O
クエン酸ストック	[0.1 M] クエン酸 21 g/1 L ddH2O
クエン酸三ナトリウムストック	[0.1 M] クエン酸三ナトリウム 29.4 g/1 L ddH2O
トリスバッファード生理食塩水 -トリトン (TBS -Triton)	0.05% TBSの100-x Triton
透過化バッファー	TBSの100-x Tritonが0.5%
ブロッキングバッファ	0.33 mL Donkey Serum(10 mL TBS-Triton入り
Edu反応液	[0.1 M] Tris pH 8.5 の 4 mL 溶液に 1 mg の CuSO4·5H2O を加えて、CuSO4·5H2O 溶液を作製します。次に、CuSO4・5H2O溶液に600 μMのAlexa488-アジド溶液1:40とL-Na+アスコルビン酸10 mg/mLを添加してから、組織に塗布します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-エチニル-2'-デオキシウリジン(Edu)	カーボシンス	NE08701
Alexa-488 アジデ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A10266 (英語)
アンチチキンネスティン	アブス	ファミコン;RRIDの番号:AB_2314882
アンチヤギDCX	サンタクルス	Cat#SC_8066;RRIDの番号: AB_2088494
アンチマウスTBR2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-4875-82;RRIDの番号: AB_11042577
共焦点ソフトウェア(Zen Black)	ツァイス顕微鏡	Zen 2.3 SP1 FP1 (ブラック)
銅(II)硫酸塩五水和物	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AC197722500
カバースリップ	デンビルサイエンティフィック	M1100-02
プラスチャージドスライド	デンビルサイエンティフィック	M1021
リン酸緩衝液(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010031
スーパーPAPペン 4mmチップ	ポリサイエンス	24230
トリスバッファードソリューション(TBS)	シグマ・アルドリッチ	T5912
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	93443