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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 免疫組織化学
- チミジンアナログ染色
- 組織切片をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に置き、正に帯電したスライドに5-8切片をマウントし、前方から後方への連続的な順序を維持し、同じ向きを維持します。ティッシュ切片を乾かしてスライドに完全に密着させ、疎水性ペンまたはPAPペンを使用して境界線を引きます。
- 透過処理バッファー(0.5% TBS(トリス緩衝生理食塩水)-トリトン)で切片を20〜30分間透過処理します。次に、TBS-tritonを使用して切片を2回、各5分間洗浄します.
注:透過処理は、細胞内抗体の浸透を助けます。透過化時間は、組織の厚さと抗体効率に応じて調整できます。あるいは、界面活性剤の濃度を上げて透過化の効力を高めることもできます。ただし、透過化時間が長くなると組織の脆弱性が増すため、透過化が長くなりすぎないように注意する必要があります。
- 表1に従ってEdu(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)反応溶液を調製します。Alexa488-アジドの最終濃度は、1 mLのEdu反応溶液中で15 μMです。
- 切片をEdu反応溶液中で30分から1時間インキュベートした後、TBS-トリトンで3回、各5分間洗浄します。このステップの後、アルミホイルでスライドさせてカバーし、光から保護します。この段階で、蛍光顕微鏡を使用してEdu反応が機能するかどうかを確認します。Edu標識細胞は、落射蛍光顕微鏡下で蛍光を発します。
- マウントされた組織切片のプロトコル
- ステップ1.1.4のスライドにマウントした組織切片を、二次抗体と同じ動物(例:ロバ血清)で育てたブロッキングバッファーを使用して30分から1時間ブロックし、次いでTBS-tritonで2回、それぞれ5分間洗浄します。
- ブロッキングステップ中に一次抗体(すなわち、チキン抗ネスチン)溶液を調製するには、ブロッキングバッファー溶液に一次抗体を1:200で混合します。スライドあたり250 μLで、組織が溶液に完全に浸漬されることを確実にするには十分です。
- ブロッキング洗浄後、一次抗体溶液中の組織切片をRTで一晩インキュベートします。使用する一次抗体に応じてこのステップを修正します.
手記： 抗体のバックグラウンド結合や非特異的結合が高い場合は、室温ではなく4°Cでインキュベートすると結果が向上する可能性があります。組織への浸透性が低い抗体は、必要に応じて2日間インキュベートすることができます。
- 組織切片をTBS-tritonで3回インキュベートし、5分間インキュベートして、余分な一次抗体を除去します。次に、ブロッキング緩衝液中で調製した蛍光色素標識二次抗体(例:Alexa 647 anti-chicken at 1:200)で組織切片をインキュベートし、室温で2時間
。
- 組織切片をTBS-tritonで5分間3回インキュベートして余分な二次抗体を除去し、300 μM DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液をPBS中1:100で室温で15分間適用します。
- 組織切片をPBSで3回インキュベートし、5分間インキュベートして余分なDAPIを除去し、綿棒または繊細なタスクワイプを使用して組織の周囲からパップペンサークルを取り除きます。切片を乾かしてから、封入剤とカバースリップを塗布します。イメージングスライドの前に、封入剤を乾かしてください。
>表1:免疫組織化学に利用される溶液
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| 不凍液 | エチレングリコール150mL+スクロース150g+500mL00mL0.1M PBで500mL溶液に充填 |
| クエン酸バッファー | 9 mL のクエン酸ストック + 41 mL のクエン酸三ナトリウム緩衝液 + 450 mL の ddH2O |
| クエン酸ストック | [0.1 M] クエン酸 21 g/1 L ddH2O |
| クエン酸三ナトリウムストック | [0.1 M] クエン酸三ナトリウム 29.4 g/1 L ddH2O |
| トリスバッファード生理食塩水 -トリトン (TBS -Triton) | 0.05% TBSの100-x Triton |
| 透過化バッファー | TBSの100-x Tritonが0.5% |
| ブロッキングバッファ | 0.33 mL Donkey Serum(10 mL TBS-Triton入り |
| Edu反応液 | [0.1 M] Tris pH 8.5 の 4 mL 溶液に 1 mg の CuSO4·5H2O を加えて、CuSO4·5H2O 溶液を作製します。次に、CuSO4・5H2O溶液に600 μMのAlexa488-アジド溶液1:40とL-Na+アスコルビン酸10 mg/mLを添加してから、組織に塗布します。 |