ミクログリアを代理バイオセンサーとして用いたニューロンにおけるナノ粒子誘起毒性の判定

要約

出典:Duffy, C. M. et al., Microglia as a Substitute Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity.J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、ミクログリアを使用してナノ粒子の神経毒性効果を評価する方法を示しています。ナノ粒子によるミクログリアの活性化、ミクログリア由来の炎症誘発性サイトカインを単離するための条件付け媒体のろ過、および条件化媒体による視床下部ニューロンの毒性試験の手順を概説しています。

プロトコル

1. ミクログリア細胞培養の維持

1. 温細胞培養培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium;DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン(PSN)を37°Cまで添加しました。
2. -80°Cでの保存から継代18〜25でBV2ミクログリア細胞の凍結ストックを取得し、37°Cのウォーターバスで細胞を迅速に解凍します。
3. 10 mLの細胞培養培地が入った75 cm²の通気フラスコに細胞を穏やかに移します。
4. フラスコを5% CO₂で37°Cでインキュベートし、24時間後に培地を吸引し、新鮮な培地と交換します。約70〜80%のコンフルエントになるまで細胞を増殖させます。

2. セルのカウントとメッキ

1. 37°Cのウォーターバスで、DMEMと1x-トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液を温めます。
2. 細胞から培地を吸引し、トリプシン500μlを添加します。37°Cで2〜5分間インキュベートします。
3. スクレーパーを使用して、フラスコから細胞を取り出し、5mlのDMEMに懸濁します。細胞を70 μmストレーナに通し、50 mLチューブに3回通します。
4. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、黒壁の透明な底板に8,000細胞/ウェルを播種し、最終容量200μlのDMEMに10%FBSおよび1%PSNを添加します。プレートを5% CO₂で37°Cで24時間インキュベートします。
5. 古いDMEMを取り外し、血清飢餓性ミクログリアに1% PSNを添加した温めたDMEM200μlと交換してください。プレートを5% CO₂で37°Cで24時間インキュベートします。

3. ミクログリアの活性化

1. 別々のチューブで、希釈銀ナノ粒子(AgNP)(0.01、0.05、または0.1 μg/ml)とビヒクル/ニュートラルコントロール(クエン酸ナトリウム、0.04 mM)を無血清DMEMに1% PSNを添加し、最終使用濃度までします。
2. 各ウェルから100 μlの培地を取り出し、100 μlの適切な処理化合物と交換します。
3. プレートを5 % CO₂で37°Cで24時間インキュベートします。

4. 条件付けされたメディアのフィルタリング

1. 各ウェルから200 μlの培地上清を回収し、収集チューブ(容量1.5〜2 ml)付きのフィルター(分子量カットオフ10 kDa)に移します。
2. 14,000 x g、室温で15分間遠心分離します。
3. フロースルー(粒子を含む上清)を捨て、フィルターを逆さまにして新しい収集チューブに入れます。
4. 1,000 x g、室温で2分間遠心分離
   手記：得られた濾過培地(分泌されたサイトカインを含む)は、6倍に濃縮されます。
5. 濃縮液の容量を400 μlに戻し、新鮮なDMEMに10% FBSと1% PSNを添加し、氷上に保存します。

5. 視床下部細胞培養の維持

1. 10% FBSおよび1% PSNを添加した温温DMEM細胞培養培地を37°Cまで調製。
2. 視床下部(mHypo-A1/2)細胞の凍結ストックを継代18 - 25で80°Cで保存し、細胞を37°Cの水浴で急速に解凍します。
3. 10 mLの細胞培養培地が入った75 cm²の通気フラスコに細胞を穏やかに移します。
4. フラスコを5% CO₂で37°Cでインキュベートし、24時間後に培地を吸引し、新鮮な培地と交換します。細胞が約70〜80%の密度になるまで細胞を増殖させます。

6. 視床下部細胞の毒性の判定

1. DMEMと1x-トリプシン-EDTA溶液を37°Cのウォーターバスで温めます。
2. 視床下部細胞から培地を吸引し、500 μlのトリプシンを加えます。37°Cで2〜5分間インキュベートします。ステップ2で説明したように、スクレーパーを使用してフラスコからセルを取り出します。
3. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、最終容量200 μl DMEMに10% FBSおよび1% PSNを添加した黒壁の透明底板で視床下部細胞を5,000細胞/ウェルでプレート化し、5% CO₂、37°Cで一晩インキュベートします。
4. マルチチャンネルピペッターを使用して100 μlの古い培地を取り出し、ろ過した濃縮コンディショニング培地100 μlを最終濃度1xまで加えます。
5. プレートを5% CO₂で37°Cで24時間インキュベートします。
6. 22 μlのレサズリン試薬を添加し、プレートを5% CO₂、37°Cで20分間インキュベー
トします。
7. マルチモード分光光度計を使用して、蛍光(560 nm EX/590 nm EM)を記録し、細胞の生存率を測定します。結果を相対蛍光単位(RFU)として報告します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞/試薬
マウスミクログリア細胞株(BV2)	Interlab Cell Line Collection(イタリア、ジェノヴァ)	ATL03001
成体マウス視床下部細胞株 mHypoA-1/2	セルティオンズ・バイオシステムズ(株)	CLU172
ダルベッコのモディファイドイーグルのミディアム	インビトゲン	〒10313-039
ウシ胎児血清	PAAラボ	A15-751
ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15640-055
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200056
銀ナノ粒子(20nm)	シグマ・アルドリッチ	730793
PrestoBlue細胞生存率試薬	インビトゲン	A13262 (英語)
マウス TNF-α ELISA Max Delux	バイオレジェンド	430904
リポ多糖類	シグマ・アルドリッチ	L4391
クエン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S4641
備品
96W 光学ボトムプレート、ブラックポリスチレン、細胞培養処理済み、蓋付き、滅菌済み	サーモフィッシャーサイエンティフィック	165305
Amicon Ultra-0.5遠心フィルターユニット、Ultracel-10メンブレン付き	EMDミリポア	UFC501008
SpectraMax M5 マルチモードマイクロプレート	分子デバイス	M5
Falcon 50mL コニカル遠心チューブ	コーニング株式会社	14-432-22
ファルコンセルストレーナー 70 μm	コーニング株式会社	08-771-2
卓上遠心分離機 5430	エッペンドルフ	22620560