ショウジョウバエの幼虫を機械的に傷つけ、神経分節神経を誘発する。

要約

出典:Danella, E. B., et al.ショウジョウバエ運動ニューロンの変性を研究するための単純なニューロンの機械的損傷の方法論。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の分節神経に機械的損傷を介して神経変性を誘発する方法を示しています。麻酔をかけた幼虫の腹側キューティクルを鉗子でつまんで、分節神経に損傷を与えます。負傷した幼虫は食物で維持されるため、損傷によって神経の運動ニューロンが変性し、神経筋接合部(NMJ)が破壊される可能性があります。

プロトコル

1. 試薬と機器の準備

1. 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl₂, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM スクロース, 5 mM トレハロース, 5 mM ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸 [HEPES]; pH 7.2) を調製します。
2. 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。
3. 1x PBSと0.01% Triton X-100を使用して1x PBTを調製します。
4. フルーツジュース寒天プレートを準備します.14 簡単に、30 gの寒天を700 mLのH₂Oとオートクレーブに混ぜます。0.5 gのメチルパラベンを10 mLのエタノールに溶解し、300 mLの濃縮果汁(ブドウまたはリンゴ)に溶液を加えます。.濃縮液をオートクレーブ滅菌した寒天溶液に混合し、10 mm x 35 mmのシャーレの蓋に注ぎます
   手記：ブドウ寒天パワープレミックスは、さまざまな会社から購入することもできます(材料の表を参照)。
5. 幼虫を機械的に傷つけることができるサイズ5の鉗子を入手します。
6. 標準的なショウジョウバエ_CO2ベースの麻酔器を使用してください。

2. ショウジョウバエの幼虫の選択

1. 25°Cで培養されたさまよう3番目の幼虫が入ったショウジョウバエのバイアルまたはボトルを取ります。
2. 外観に基づいて、10匹の個々の2番目または3番目の幼虫を選択します。3齢幼虫は前枝状門の出現で識別できますが、2齢幼虫はより小さく、よりクラブ状の前気門を持っています
   手記：幼虫のステージは、タイミングによっても識別できます。25°Cでは、2番目の幼虫は孵化後約48時間後に現れ、3番目の幼虫は約24時間後に脱皮します。NMJでの神経変性を調べることに興味があるなら、2番目の幼虫を傷つける必要があります。

3. ショウジョウバエの幼虫の機械的損傷に対する準備

1. 個々の幼虫を鉗子または絵筆で慎重に拾い上げ、決して圧縮しないように注意してください。
2. 10匹の幼虫を冷たい1X PBSまたは解剖緩衝液が入ったガラス皿に直接入れて、食物の破片を取り除き、幼虫の運動性を減速させます。

>4. ショウジョウバエの幼虫の機械的損傷と治療

1. 個々の幼虫を_CO2麻酔装置に置きます。
2. 解剖顕微鏡で、キューティクルを通る分節神経を視覚化するために、各幼虫を慎重に背側に転がします。
3. 位置サイズ5鉗子は、口のフックから始めて幼虫の長さの約1/2から2/3の方法を下ります。位置が決まったら、分節神経を含む腹側キューティクルの約1/3をサイズ5の鉗子でつまみます。
   1. 幼虫の分節神経が損傷することを確実にするために、分節神経を押しつぶすのに十分な力を加えますが、キューティクルはそのままにしておきます。正しい力の量を決定するには、10匹の幼虫を粉砕し、5時間後の死亡率が50%未満であることを確認してください。
4. 傷害後、幼虫を約0.5gのイーストペーストが入ったフルーツジュース寒天プレートに慎重に移します。各幼虫をその前端がイーストペーストの上にくるように配置して、運動性が乱れても給餌を続けるようにします
   手記：幼虫の分節神経が損傷したことを確実にするために、寒天プレートに移した後に幼虫の運動性の乱れを観察することができます。負傷した幼虫は、損傷部位の後方で効果的に麻痺しますが、それでも口のフックを動かして餌を食べることができます。負傷後の動物の死亡率が高いことは一般的であるため、実験に必要な動物よりも20〜50%多く動物を負傷させるのが最善です。
5. イーストペーストと10匹の負傷した幼虫が入った寒天プレートを空の100 x 15 mmシャーレの底に置きます。負傷した幼虫が寒天プレートに入っているこのペトリプレートを湿ったペーパータオルで覆い、ペーパータオルが幼虫や寒天プレートに触れないようにします。このペトリ皿を室温(RT)で大きな密閉容器に入れます。
6. 損傷後、指定された期間(6、12、または24時間)後に解剖のために幼虫を回収します.
   手記：軸索細胞骨格に対する損傷の即時の影響を調べるために、幼虫を損傷直後に解剖することができます。軸索輸送の欠陥を調べるために、幼虫は損傷の約6時間後に解剖することができます。損傷の約12時間後にはユビキチン化タンパク質の蓄積が観察され、損傷から24時間後にはNMJでの運動ニューロンの変性が観察されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロ解剖ハサミ	ファインサイエンスツール	15000から08
デュモン #3 鉗子	ファインサイエンスツール	11231から30	サイズ3を好む人もいれば、サイズ5を好む人もいます
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11251から30	サイズ3を好む人もいれば、サイズ5を好む人もいます
CO2エアタンク	テックエア	国連1013	さまざまなタンクサイズを購入できます
CO2麻酔装置	ジェネシーサイエンティフィック	59〜114
ステンレス製ピン、サイズ0.1	ファインサイエンスツール	26002-10
SylGard 184 シリコーンエラストマー、ベース、硬化剤	ダウコーニング	3097358から1004	解剖プレートを注ぐには
解剖ステレオマイクロスコープ	アムスコープ	SM-1BZの
光源	アムスコープ	HL150-AY-220V
フライスタッフグレープジュース寒天プレミックス	ジェネシー・サイエンティフィック	47から102
顕微鏡スライド	ジェネシー・サイエンティフィック	29から101
ガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene ユーティリティボックス	フィッシャーサイエンティフィック	03-484C	幼虫の回復のための湿った部屋を作成するのに使用

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