マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

Abstract

出典: Tietz, S. M. et al. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. EAE導入

1. 気化器システムを使用して、C57BL/6マウスをイソフルオランで麻酔します。マウスに麻酔を誘発するには、マウスを小さなインキュベーションチャンバー内で酸素中の4.5%イソフルオランに曝露してから、マウスを2.1%イソフルオランを含むフェイスマスクに移します。マウスの低体温を防ぐために、加熱パッドを備えた麻酔ユニットを使用してください。
2. 麻酔をかけたマウスを片手で固定し、まず30μLのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)-ペプチド_{aa 35-55}(MOG_35-55)/フロイントのアジュバント(CFA)-エマルジョンを後肢の脇腹(図1:1+2、合計60μL、左脇腹30μL、右脇腹30μL)に皮下注射します鼠径リンパ節に近接します。
3. マウスを腹に置き、20 μLのMOGaa_35-55/CFA-エマルジョンを尾根の左右の軟脂肪組織(図1:3 + 4、合計40 μL、左側尾根20 μL、右側尾根20 μL)とMOGaa_35-55/CFA-エマルジョンの少量の液滴をマウスの首に注入します(図1: 5)。
4. 百日咳毒素(PTx)溶液100μLをマウス腹腔内に注入します。腸への注射を避けるために、マウスの頭を体の中心の下に保持します。
5. 維持食(押出し主要栄養素:粗タンパク質18.5%、粗脂肪4.5%、粗繊維4.5%、粗灰分6.5%、デンプン35%、代謝エネルギー:13.1MJ / kg)を繁殖食(押出物の主要栄養素:粗タンパク質23.5%、粗脂肪5.5%、粗繊維3%、粗灰分5.7%、デンプン36%、代謝エネルギー:14.3MJ / kg)に置き換えて、予想される臨床疾患の前および最中にマウスに高エネルギー含有量の食物を提供します。
6. フェイスマスクを取り外し、マウスを温めパッド付きのホームケージに移します。10分後、マウスが完全に覚醒し、動き出していることを確認します。
7. 最初の治療の48時間後にPTx注入(ステップ1.4)を繰り返します。

2. EAEマウスの採点

1. EAEマウスの健康状態は、毎朝ケージの中を見て確認しましょう。
2. 毎日午後にEAEマウスを採点します。
3. EAE実験に参加したマウスをケージから取り出し、指で上に動かして尾に緊張があるかどうかを確認します。健康なマウスは尻尾を上げ続けます(尻尾には緊張があります)。臨床EAEが開始した場合、尾の緊張は低くなり、尾が徐々に下がることで見えます。最終的に、マウスは尻尾をまったく持ち上げることができなくなります。
4. EAE実験に参加したマウスを1匹ずつクリーンベンチに置き、歩行行動を観察し、記録します。疾患の重症度の評価のための採点基準(EAEスコア)については、表1を参照してください。
5. 実験に含まれるすべてのマウスの体重を評価し、文書化します。
6. 臨床EAEスコアが1を示すマウスが十分な食物と水分を摂取するために、湿らせた食物をケージの底にあるプラスチック皿に供給し、毎日リフレッシュします。

Results

図1:EAEインダクションの注入部位のグラフ表現:1)右側面への30μLのMOGエマルジョンの注入部位、2)30μLのMOGエマルジョンの左側面への注入部位、3)20μLのMOGエマルジョンの左テールルートへの注入部位、4)30μLのMOGエマルジョンの右テールルートへの注入部位、 5)首にMOGエマルジョンの小さな液滴のための注射部位。

>表1:EAE疾患の重症度を評価するための採点基準。

0〜3ポイントスコア

条件...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
繁殖用食品	例:PROVIMI KLIBA SA	3336
個別換気ケージ、ブルーラインタイプIIまたはIII	例:テクニプラスト	1145T、1285L
雌C57BL/6Jマウス(8-12週)	例:Janvier Labs		女性、8-12週間
18G x 11/2インチ (1.2mm x 40mm) 注射針	例:BD、BDマイクロランス3	304622
27G x 3/4インチ - Nr.20(0.4mm x 19mm)注射針	例:BD、BDマイクロランス3	302200
30G x 1/2インチ (0.3 mm x 13 mm) 注射針	例:BD、BDマイクロランス3	304000
不完全なフロイントのアジュバント(IFA)	例:Santa Cruz Biotechnology社	SC-24648	4°Cで保存
メンテナンスフード	例:PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55ペプチド	例:GenScriptの場合		-80°Cで保存
結核菌H37RA	例:BD	231141	4°Cで保存
NaCl 0.9 %	B.ブラウン	3535789
オムニカン50 30G x 1/2インチ	B.ブラウン	9151125S
百日咳毒素	例)株式会社生物研究所一覧	180	4°Cで保存
ステッチハサミ	F.S.T(エフエスティー)	15012-12
シリンジ1 ml	例:プリモ	62.1002
シリンジ10 ml	例:CODAN Medical ApS	2022年05月