EAEマウスモデルにおける蛍光色素を用いた血液脳関門破壊の決定

要約

出典: Tietz, S. M., et al., Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオは、EAEマウスモデルにおける血液脳関門の破壊を評価する手順を示しています。さまざまなサイズの蛍光色素が眼窩後方向に注入され、脳の血管を循環します。小さい色素は隙間から脳組織に漏れますが、大きい色素は混乱が深刻な場合にのみ入り、バリア損傷の程度と相関します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 生体内透過性アッセイ

1. 解決策の調製:
   1. デキストランストック溶液の場合は、10 kDaのDextic Flor 488と3 kDaのDextram Texas Red10 mgを500 μLの0.9%塩化ナトリウム溶液(20 mg/mL)に溶解します。
   2. デキストランワーキング溶液については、注射の直前に、10 kDa Dextran Alexa Fluor 488ストック溶液(20 mg/mL)55 μLをシーリングフィルムにピペットで移し、3 kDaデキストランTexas Redストック溶液55 μL(20 mg/mL)を加えます。100 μLを混合して使い捨ての細い注射器に集めます(最終濃度2 mg / 100 μL)。
   3. 10%ホルムアルデヒド(パラホルムアルデヒド、またはPFA)ストック溶液の場合、10 gのPFA超高純度粉末、100 mLのPBS、および200 μLの1N水酸化ナトリウム(NaOH)を清潔なガラスビーカーに混ぜ合わせ、マグネチックスターラーを使用して攪拌しながら正確に56°Cに加熱します。PFAが完全に溶解するまで、56°Cで30分間保持します。室温まで冷まし、pHを7.4に調整し、ペーパーフィルターでろ過します。20°Cで保存します。ストック溶液は、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSを使用してさらに希釈できます。
2. まもなく、実験的な自己免疫性脳脊髄炎、またはイソフルランによるEAEに苦しんでいる健康なC57BL / 6マウスまたはC57BL / 6マウスに麻酔をかけます(マウスは約1分間鎮静されます)。自動化システムを使用します(マウスは誘導チャンバーで酸素中の4.5%イソフルランにさらされ、次に2.1%イソフルランを含むフェイスマスクに移されます)。
3. 麻酔をかけたマウスをテーブルの横方向の位置に置き、マウスが目覚める前に100μLの蛍光トレーサーをマウスに静脈内(例:. 後眼窩)注入します。.
4. すぐにフェイスマスクを取り外し、マウスが完全に目を覚まし、短時間の麻酔後に動き出していることを確認します。トレーサーを15分間循環させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デキストラン Alexa Fluor 488 (10,000 MW)	例:分子プローブ	D22910	-20°Cで保存し、光から保護してください
デキストランテキサスレッド(3000 MW)	インビトゲン	D3328	-20°Cで保存し、光から保護してください
メンテナンスフード	例:PROVIMI KLIBA SA	3436
パラホルムアルデヒド	メルク	30525-89-4
NaCl 0.9 %	B.ブラウン	3535789
シーリングフィルム(パラフィルムMなど)	例:シグマ・アルドリッチ	P7793
シリンジ1 ml	例:プリモ	62.1002