マウス頭蓋顔面組織の免疫染色

要約

出典:Yang, J., et al., Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、蛍光顕微鏡を使用して核マーカーの発現を評価し、細胞増殖とシグナル伝達活性を決定するために、マウス胚頭蓋顔面組織からの凍結切片の免疫蛍光染色を示しています。

プロトコル

>免責事項テキスト:動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査および承認されています。

1. 免疫蛍光染色

1. -80°Cからスライドを取り出し、スライドを室温で1時間放置し、エアドライセクションまで保管します。0.1% PBST (0.1% ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテル含有 PBS; 材料表参照) でスライドを 5 分間 3 回、それぞれ 5 分間すすぎ、OCT を洗い流し、切片を透過化します。
2. オプションで、抗原賦活化を行います(オプション)。
   1. スチーマーまたはウォーターバスで染色皿中のクエン酸緩衝液(10 mMクエン酸ナトリウムpH 6)を95〜100°Cに予熱し、スライドをクエン酸緩衝液に浸し、10分間インキュベー
   トします。
   2. スチーマーまたはウォーターバスから汚れた皿を取り出し、スライドを室温で20分以上冷却します15.
      手記： 代替として、Tris-EDTAバッファー(10 mM Tris base、1 mM EDTA、0.05% Tween 20、pH 9.0)またはEDTAバッファー(1 mM EDTA、0.05% Tween 20、pH 8.0)を使用して、熱誘起抗原賦活化を行います。ホットスチーマーに加えて、圧力鍋、電子レンジ、またはウォーターバスを使用して、熱誘起抗原賦活化を行います。トリプシンまたはペプシンを使用した酵素誘導抗原賦活化は、別の代替手段です。酵素回収の濃度と処理時間を最適化し、切片の損傷を防ぎます。抗原賦活化法を抗体/抗原の組み合わせごとに最適化します。
3. 各スライドを200 μLのブロッキング溶液(0.1% PBSTで希釈した5%ロバ血清)と室温で30分間インキュベートし、リンスせずにブロッキング溶液を除去します。
4. 各スライドを100 μLの一次抗体またはブロッキング溶液で希釈した抗体を室温で1時間、またはO/Nで4°Cでインキュベートし、スライドをPBSで3回、室温で10分間すすぎます。
5. ブロッキング溶液で希釈した二次抗体100 μLで各スライドを室温で1時間インキュベートし、PBSでスライドを室温で10分間3回すすぎます。
6. スライドを取り付けます。
   1. スライド上にDAPI(4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を塗布した退色防止剤を2滴加えます。次に、カバースリップで覆います。
   2. イメージングの準備ができるまで、暗所で4°Cで保存してください.
      手記： 別の方法として、まずRTでPBSで1:2,000に希釈したDAPIまたはHoechst 33324色素で核を標識し、次にグリセロールでマウントします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 488-ヤギ抗ウサギ二次抗体	インビトゲン	A-11034
DAPI付き退色防止封入剤	インビトゲン	P36931
ウシ血清アルブミン	シグマ	A2153の
カバースリップ	フィッシャーブランド	12-545-E
クライオスタット	ライカ	CM1850
EDTAの	シグマ	E6758
蛍光顕微鏡	オリンポス	BX51
顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	12-550-15
OCTコンパウンド	フィッシャーヘルスケア	23-730-571
パラホルムアルデヒド(PFA)	シグマ	P6148
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	P4417
ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル	シグマ	T9284	トリトンX-100
ウサギ抗Ki67抗体	細胞シグナル伝達技術	9129	ロット#:3;RRID:AB_2687446
ウサギ抗pSmad1/5/9抗体	細胞シグナル伝達技術	13820	ロット#:3;RRID:AB_2493181
クエン酸ナトリウム	シグマ	1613859
トリス	シグマ	10708976001

の 型 型 名