蛍光イメージングによるニューロンの小胞運動の可視化

Abstract

出典:Tsuruta, F., et al. Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、ニューロン小胞が特定の蛍光タンパク質で標識され、その動きを視覚化する方法を示しています。まず、蛍光タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクション剤とインキュベートし、次にニューロンの培養物に導入します。その後、ニューロンの画像を取得して分析し、小胞の動きを追跡します。

Protocol

1. イメージング小胞の運動性

1. 各タイプの小胞を標識するプラスミドを準備します。例えば、初期エンドソームにはEGFP-Rab5を、後期エンドソームにはEGFP-Rab7を、リソソームにはLAMP-EGFP、オートファゴソームにはEGFP-LC3を使用します
   手記：これらのプラスミドは、tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp からのリクエストに応じて入手可能です。通常、トランスフェクション試薬を使用して、3〜5日間のin vitro(DivisionまたはDIV)ニューロンにこれらのプラスミドをトランスフェクションできます。
2. ピペッティングにより、4.0 μgのプラスミドを200 μLの無血清培地と混合します。別のチューブで、8 μL のトランスフェクション試薬 (材料表を参照) を 200 μL の無血清培地で希釈します。室温(RT)で5分間インキュベートします。
3. ステップ1.2でプラスミド溶液とトランスフェクションリージェント溶液をピペッティングで混合します。室温で20分間インキュベートします。
4. ステップ1.3の無血清培地と400μLのプラスミド溶液を、皮質ニューロン、脳皮質培養培地を含む各コーティングガラス底皿に加えます。ニューロンを37°Cで5%_CO2インキュベーターで30分間インキュベートします。培地を2mLの大脳皮質培養培地と交換します。ニューロンを37°Cで5%_CO2インキュベーターで1〜2日間インキュベートします
   手記：1x B-27サプリメント、2 mM L-グルタミン、および100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシンを補充したニューロン基礎培地からなる大脳皮質培養培地を準備します。
5. トランスフェクションの1〜2日後、画像取得のためにトランスフェクションした細胞を選択します.
   手記：DIVが7未満の未熟ニューロンは、動的な小胞運動性を示す傾向があります。蛍光プローブを適度に発現するニューロンを選択すると、高発現ニューロンを選択すると鮮明な画像が得られないため、蛍光プローブを適度に発現するニューロンを選択します。また、軸索と樹状突起の識別を容易にするために、長い軸索と複雑な樹状突起を持つ錐体ニューロンなどの典型的なニューロン形状を選択します(図1Aを参照)。
6. タイムラプスイメージングシステムによる画像取得:イメージングには、40X Plan Apo 0.95NAまたは100X Plan Apo VC NA1.4対物レンズを備えた電荷結合素子(CCD)カメラを搭載した蛍光顕微鏡を使用します。インキュベーションシステムを使用して37°Cで温度を制御します。画像取得ソフトウェアによって制御される100秒の期間で、1フレーム/5秒でニューロン画像を取得します。あるいは、300 秒の期間で 2 秒ごとに 1 フレームなど、より短い間隔で長い時間で画像を取得します。
   手記：逐次画像の撮影にはさまざまなアプリケーションが利用可能であり、その多くはこの方法に適しています。したがって、特定のアプリケーションはお勧めしません。代わりに、各研究者は利用可能なアプリケーションを使用する必要があります。

2. 画像解析

1. ImageJソフトウェアでManual Trackingを使用してすべての連続画像を開きます.
   手記：これまで、マニュアルトラッキングはトラッキング実験に広く使用されてきました。マニュアルトラッキングは、ファブリス・コーデリエール博士によって開発されました。詳細な書面による指示はオンラインで入手できます。解析では、十分な数の画像を使用することで、イメージングデータの品質が向上します。20枚以上の画像を使用することをお勧めします。
2. 連続したイメージを組み合わせるには、 を選択します→ → を選択します。クリック。
3. →を選択すると、追跡ウィンドウがポップアップ表示されます。
4. のチェックボックスをクリックし、パラメータセクションでトラッキングパラメータを定義します。
   手記：時間間隔、x/yキャリブレーション、zキャリブレーション、センタリングの検索正方形サイズ、ドットサイズ、線幅、フォントサイズなど、いくつかのパラメータを設定できます。この簡易アッセイでは、時間間隔と x/y キャリブレーションの両方が定義されました。他の実験状況では、他のパラメータも定義する必要がある場合があります。ここで使用されるパラメータは、 は 5 秒で、40X Plan Apo 0.95NA 対物レンズの場合は 0.26642 μm、100X Plan Apo VC NA1.4 対物レンズの場合は 0.10657 μm です。
5. パラメータを定義したら、 をクリックして新しいトラックを開始します。
6. 目的の小胞(たとえば、図1A(右パネル)の青と赤の矢印で示されている小胞)を決定したら、連続画像内の信号の中心をクリックしてxy座標を記録します。記録された xy 座標、距離、および速度の結果は、新しいウィンドウに表示されます。
   手記：リソソームの場合、ニューロンでは大きな明るい蛍光シグナル(例:図1A(右パネル)、オレンジ色の矢印)がよく観察されます。これらのシグナルは、蓄積した小胞または病的な静脈瘤のいずれかを示すことがあるため、運動性を定量化するためにこれらのシグナルは避けるべきです。
7. 手順 2.6 を繰り返して、すべての連続した画像から小胞の xy 座標を収集します。参照点を選択した後、各画像は自動的に連続する画像に進みます。
8. これらのデータを新しいテーブル(スプレッドシートなど)にエクスポートします。適切なソフトウェアを使用して、適切なグラフを作成してください(資料の表を参照).
   手記：データを分析するには、列を選択し、この列のすべての値を合計して、図 1B のように運動距離を棒グラフとして表示します。さらに、この手順を繰り返し、総運動距離の平均を計算し、図 1C のように棒グラフとして表示します。棒グラフと波形データを作成するソフトウェアは、材料表に示されています。

Results

図1:ニューロン樹状突起におけるリソソームの運動性。(A)マウス皮質ニューロン(4DIV)にLAMP-EGFPプラスミドを2日間トランスフェクションした。この画像は、樹状突起中のLAMP-EGFP含有小胞の運動性を示しています。挿入図は、LAMP-EGFP陽性小胞のタイムラプス画像を示しています。赤い矢印は動いている小胞を示し、青い矢印は休息している小胞を示しています。オレンジ色の矢印は、上記のように、より大きな蛍光シグナルを示しています。スケールバー = 20 μm. (B) 図AのLAMP-EGFP陽性小胞の時間依存のx軸位置。(b)と書かれた赤丸の小胞は動いており、(a)と書かれた青丸の小胞は休息しています。スケールバー:5μm(左)。棒グラフはLAMP-EGFPの総移動距離を示しています(右)。(C)棒グラフは、LAMP-EGFP含有小胞の平均運動距離を示しています。(n = 5、平均±...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
神経基礎媒体	サーモフィッシャー	21103-049
オプティMEM	サーモフィッシャー	31985070	無血清培地
ペニシリンストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122
L-グルタミン	サーモフィッシャー	25030081
B-27	サーモフィッシャー	17504044
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ	P7280
ポリ-L-オルニチン	シグマ	P4957
リポフェクタミン 2000	サーモフィッシャー	11668027	トランスフェクション試薬
ポリエチレンイミン「マックス」	ポリサイエンス	24765	トランスフェクション試薬。リポフェクタミン2000の代替として、滅菌水に溶解した0.1mg/mlのポリエチレンイミンが利用可能です。しかし、それは低効率で毒性が高いです。
ビオレボ BZ-9000	キーエンス	NAの
インキュベーションシステム INUG2-K13	トカイヒット	NAの
GraphPad Prismバージョン6.0	GraphPadソフトウェア	NAの
Excel バージョン 15	マイクロソフト	NAの
イメージJバージョン1.47	NAの	NAの