免疫蛍光法を用いたマウス脳におけるシナプス前タンパク質の分布の定量化

要約

出典:Wallrafen, R., et al. Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、特定のシナプス前タンパク質の分布を定量化するためのマウス脳切片の免疫蛍光染色を実演しています。このプロセスでは、非特異的な部位をブロックし、標的タンパク質と参照マーカーに一次抗体を適用し、続いて二次抗体の標識と核対比染色を行います。リファレンスマーカーは、一貫したベースラインを提供することで正確な定量を保証し、シナプス前タンパク質の分布は共焦点顕微鏡を使用して脳領域全体で分析されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫蛍光

1. ブロッキングバッファー、抗体バッファー、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2などの溶液を調製します(表1を参照)。
2. スライスをリン酸緩衝液(PB)で一度すすぎ、過剰な最適切断温度(OCT)化合物を取り除きます。
   1. 脳のスライスを吸い込まずにプラスチックピペットで溶液を取り除きます。1000 μLのピペットで250 μLの新鮮なPBを加えます><。 注意：スライスは乾かないように、水分をよく取り除いて追加します。
3. プラスチックピペットでPBを取り外し、1000μLのピペットでウェルあたり250μLのブロッキングバッファーを追加します。シェーカー上で室温(RT)で3時間インキュベートします。
4. インキュベーション時間中に、反応チューブ内の抗体バッファーで一次抗体を希釈します。ウェルあたり250 μLの抗体バッファーを使用し、2 μLのピペットを使用して溶液に直接ピペッティングし、適切な量の抗体(表2を参照)を添加します。数回静かにピペッティングして溶液を混合します。適切な混合を確保するために、直後に渦巻きます.
   手記：バックグラウンド蛍光を測定するには、一次抗体を添加せずに染色も行う必要があります。そのためには、プロトコルに従って、一次抗体を含まない抗体溶液でスライスをインキュベートします。
5. インキュベーション時間後、プラスチック製ピペットでブロッキングバッファーを取り出し、1ウェルあたり250 μLの一次抗体を含む抗体溶液を加えます。スライスを一次抗体と混合して、シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、スライスを洗浄バッファー1 3xでRTで10分間シェーカーで洗います。
   1. プラスチックピペットで培地を取り出し、ウェルごとに300μLの洗浄バッファー1を加えます。室温で10分間インキュベートします。3回繰り返します。
7. 洗浄ステップでは、フルオロフォア結合二次抗体を反応チューブ内の抗体バッファーで希釈します。ウェルあたり250 μLの抗体バッファーを使用し、2 μLのピペットを使用して溶液に直接ピペッティングし、適切な量の抗体(表2を参照)を添加します。数回静かにピペッティングして溶液を混合します。適切な混合を確保するために、直後に渦巻きます.
   注意：抗体は光感受性であるため、この時点以降のすべてのステップは暗闇で実行する必要があります。
8. 洗浄ステップの後、プラスチックピペットで洗浄バッファーを取り出し、ウェルごとに二次抗体を含む抗体溶液250μLを追加します。スライスを二次抗体と混合して、暗所の室温で90分間インキュベートします。
9. スライスを洗浄バッファー2 3回でRTで10分間洗浄します。
10. 洗浄ステップ中に、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を0.1 M PBで1:2000の濃度で希釈します。
11. プラスチックピペットで洗浄バッファー2を取り外し、ウェルごとに250μLのDAPI溶液を加えます。シェーカーでRTで5分間インキュベートします。
12. プラスチックピペットでDAPI溶液を取り出し、1000μLのピペットでウェルあたり500μLの0.1M PBを加えます。
13. 顕微鏡スライドにスライスを取り付けます。
    1. 顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細いブラシで、0.1 M PBを3滴スライド上に加えます。1滴につき1スライスを顕微鏡スライドに置きます。
    2. 細いブラシを使用して、顕微鏡スライド上のスライスを平らにし、向き
    を変えます。
    3. すべてのスライスが正しく配置されたら、ティッシュで余分なPBを取り除き、スライドを慎重に乾かします
       注意：脳のスライスを完全に乾燥させることは避けてください。
    4. スライドに80μLの包埋培地を加えます。カバースリップをスライド上に慎重に下げ、脳のスライスを埋め込みます。
    5. スライドをドラフトで1〜2時間乾燥させ(光への露出を避けるために蓋をします)、4°Cの顕微鏡スライドボックスに保管します
       手記： ここでプロトコルを一時停止できます。

2. イメージング

1. 埋め込み媒体が完全に硬化したら、顕微鏡スライドを共焦点顕微鏡の下に置きます.
   手記：落射蛍光顕微鏡とデコンボリューションソフトウェアを組み合わせても、同様の画質が得られるはずです。
2. 各チャンネルのレーザー強度を増減してレーザー設定を調整し、露出オーバーになるピクセルが少なくなり、グレー値が最大限に分布するようにします。
3. さまざまなチャネルの脳全体のスライスの仮想組織を取得します。
   1. イメージングソフトウェアで、Tilesオプションを選択し、Tile Region Setupを使用してブレインスライスを手動で描きます。
   2. サポート ポイントをタイル領域全体に分散し、[Verify Tile Regions/Positions] を押して、さまざまなサポート ポイントのフォーカスを調整します。
   3. 結果の画像の希望の解像度とファイルサイズに応じて、取得モードで設定を調整し、スキャンを開始します。
4. スキャンが終了したら、スティッチング機能を使用して仮想組織を処理します。Image Export機能を使用して、ファイルを.tifとしてエクスポートします。

3. コンピュータベースの分析

1. 1つの画像のすべての単一チャネルをFIJIにロードするには、[ファイル]|開いています。
2. フリーハンド選択ツールを使用して、DAPI チャネルの 1 つの半球を描きます。選択のマスクを作成するには、[編集] |セレクション|マスクを作成します。
3. 単一チャンネル(Moverおよびsynaptophysin)の平均蛍光強度を決定するには、[Analyze]|メジャー.
   手記：各チャンネルの平均蛍光強度値を決定するには、必ず異なるチャンネルを選択してください。
4. 単一チャンネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。
5. 関心領域内の単一チャネルの平均蛍光強度を決定するには、フリーハンド選択ツールでも領域を描写します。マウスの脳地図帳を参考にしてください。
6. すべての半球とすべての対象領域について、手順3.1〜3.5を繰り返します。
   手記：各半球の値を個別に決定して、後で対象領域の値と半球の値を比較します (手順 4.2 を参照)。

>4. データの取り扱い

1. バックグラウンド蛍光が高い場合は、バックグラウンドの減算が必要になることがあります。そのためには、参照タンパク質(ここではシナプトフィジン)に対する一次抗体なしで処理したスライスの平均蛍光強度を決定し、脳領域と半球について得られたすべての値からその値を差し引きます。
2. すべての半球およびすべての関心領域の単一チャネルの平均蛍光強度が決定されたら(表3を参照)、Moverの値をsynaptophysinの値(表3の黄色)で割ることにより、Moverとsynaptophysinの比率を計算します。このアクションは、すべての半球とすべての対象領域に対して個別に実行します。
3. 1 つの関心領域について得られた比率を、対応する半球 (表 3 のオレンジ色) で得られた比率で除算して、半球に対する関心領域の比率を決定します。
4. 相対的なムーバーの存在量を決定するには、4.2で得られた比率を1からの偏差(表3の赤)を決定してパーセンテージに変換します。したがって、レシオが1.25の場合、相対的なムーバーの存在量は平均を25%上回り、レシオが0.75の場合、ムーバーの相対的な存在量は平均を25%下回ります。

>表1:このプロトコルで使用されるソリューション。

固定剤(500mL)
パラホルムアルデヒド20gを混ぜる(総濃度:4%) 50 mL 10x PBS原液(総濃度:1x) 450 mL bidest H2OAdjustpH 7.4、NaOH 注:PBS中のパラホルムアルデヒドを分解するには、溶液を加熱します。PFAは70°Cを超える温度で崩壊するため、70°C以上に加熱しないでください 注意:PFAは毒性があり、発がん性があり、催奇形性がある可能性があります。PFAを取り扱うときは手袋を着用し、ドラフトの下で作業してください。摂取を避けてください。
0.1M PB (1L)
ストックソリューション X 35.61 g Na2HPO4.2H 2O in 1 L bidest H2O	ストックソリューション Y 27.60 g NaH2PO4.2H 2O in 1 L bidest H2O
385mL原液X を混ぜる 115 mL原液Y 500 mL バイデスト H2O
ブロッキングバッファー(50mL)
Mix 1.25 mL 正常ヤギ血清(総濃度:2.5%) 1.25 mL 正常ロバ血清(総濃度:2.5%) 0.5 mL 非イオン性界面活性剤 (Triton-X100, total conc.: 1%) 47 mL 0.1 M PB
抗体バッファー(50mL)
Mix 0.25 mL 正常ヤギ血清 (total conc.: 0.5%) 0.25 mL 正常ロバ血清(総濃度:0.5%) 0.1 mL 非イオン性界面活性剤 (総濃度: 0.2%) 49.4 mL 0.1 M PB
洗浄バッファー1(50mL)
Mix 1 mL 正常ヤギ血清 (total conc.: 2 %) 49 mL 0.1 M PB
洗浄バッファー2(50mL)
Mix 0.5 mL 正常ヤギ血清 (total conc.: 1 %) 49.5 mL 0.1 M PB

>表2:このプロトコルで使用される抗体。

>一次抗体
対象	宿主種	RRIDの	濃度
ムーバー	兎	AB_10804285	1:1000
シナプトフィジン	モルモット	AB_1210382	1:1000
二次抗体
対象種	宿主種	フルオロフォア	濃度
兎	驢馬	アレクサフロー 647	1:1000
モルモット	山羊	アレクサフロー 488	1:1000

表 3: データ処理の例。

>半球
半球 #	平均蛍光強度シナプトフィジン(A.U.)	平均蛍光強度 Mover (A.U.)	レシオムーバー/シナプトフィジン
1 2 3 4 5 6	29.134 31.008 38.641 30.775 21.658 27.277	22.810 24.046 29.324 25.444 18.091 23.364	=C3/B3 0.783 =C4/B4 0.775 =C5/B5 0.759 =C6/B6 0.827 =C7/B7 0.835 =C8/B8 0.857
海馬
半球 #	平均蛍光強度シナプトフィジン(A.U.)	平均蛍光強度 Mover (A.U.)	レシオムーバー/シナプトフィジン	半球に対する比率	相対ムーバーの存在量(%)
1 2 3 4 5 6	35.26 33.955 41.231 39.853 30.129 28.737	29.889 27.825 31.978 31.787 27.817 25.861	=C11/B11 0.848 =C12/B12 0.819 =C13/B13 0.776 =C14/B14 0.798 =C15/B15 0.923 =C16/B16 0.900	=D11/D3 1.083 =D12/D4 1.057 =D13/D5 1.022 =D14/D6 0.965 =D15/D7 1.105 =D16/D8 1.051	=(E11-1)*100 8.269 =(E12-1)*100 5.673 =(E13-1)*100 2.200 =(E14-1)*100 -3.528 =(E15-1)*100 10.530 =(E16-1)*100 5.064

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL 反応チューブ	エッペンドルフ	30120094
50 mL 反応チューブ	グライナーバイオワン	227261
マルチウェル24ウェル	フィッシャーサイエンティフィック	087721H
プラスチックピペット(使い捨て)	ザルシュテット	8,61,176
1000 mLピペット	レイニン	17014382
2mlピペット	エッペンドルフ	3123000012
ボルテックスジーニアス3	イカ	3340001
Menzel顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	10144633CFの
実体鏡	ライカ
LSM800	ツァイス		共焦点顕微鏡
PBSの(10X)	ロシュ	11666789001
ティッシュテック	さくら	4583	10月
Na2HPO4	バイオフロックス	5155KG001
NaH2PO4	メルク	1,06,34,60,500
通常のヤギ血清	メルクミリポア	S26-100ミリリットル
ノーマルドンキーセラム	メルク	S30〜100ミリリットル
トリトンX-100	メルク	1,08,60,31,000
ウサギの反ムーバー	シナプス系	RRIDの番号: AB_10804285
モルモット抗シナプトフィジン	シナプス系	RRID:AB_1210382
ロバ反ウサギAF647	ジャクソン免疫研究	RRID:AB_2492288
ヤギアンチマウスAF488	ジャクソン免疫研究	RRIDの番号: AB_2337438
モヴィオル4-88	カルバイオケム	475904
ZEN2 blueソフトウェア	ツァイス		顕微鏡ソフト
フィジー	イメージJ		解析ソフトウェア
マイクロソフトエクセル	マイクロソフト

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