免疫蛍光法を用いたマウス脳におけるシナプス前タンパク質の分布の定量化

Abstract

出典:Wallrafen, R., et al. Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、特定のシナプス前タンパク質の分布を定量化するためのマウス脳切片の免疫蛍光染色を実演しています。このプロセスでは、非特異的な部位をブロックし、標的タンパク質と参照マーカーに一次抗体を適用し、続いて二次抗体の標識と核対比染色を行います。リファレンスマーカーは、一貫したベースラインを提供することで正確な定量を保証し、シナプス前タンパク質の分布は共焦点顕微鏡を使用して脳領域全体で分析されます。

Protocol

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫蛍光

1. ブロッキングバッファー、抗体バッファー、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2などの溶液を調製します(表1を参照)。
2. スライスをリン酸緩衝液(PB)で一度すすぎ、過剰な最適切断温度(OCT)化合物を取り除きます。
   1. 脳のスライスを吸い込まずにプラスチックピペットで溶液を取り除きます。1000 μLのピペットで250 μLの新鮮なPBを加えます><。 注意：スライスは乾かないように、水分をよく取り除いて追加します。
3. プラスチックピペットでPBを取り外し、1000μLのピペットでウェルあたり250μLのブロッキングバッファーを追加します。シェーカー上で室温(RT)で3時間インキュベートします。
4. インキュベーション時間中に、反応チューブ内の抗体バッファーで一次抗体を希釈します。ウェルあたり250 μLの抗体バッファーを使用し、2 μLのピペットを使用して溶液に直接ピペッティングし、適切な量の抗体(表2を参照)を添加します。数回静かにピペッティングして溶液を混合します。適切な混合を確保するために、直後に渦巻き....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 反応チューブ	エッペンドルフ	30120094
50 mL 反応チューブ	グライナーバイオワン	227261
マルチウェル24ウェル	フィッシャーサイエンティフィック	087721H
プラスチックピペット(使い捨て)	ザルシュテット	8,61,176
1000 mLピペット	レイニン	17014382
2mlピペット	エッペンドルフ	3123000012
ボルテックスジーニアス3	イカ	3340001
Menzel顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	10144633CFの
実体鏡	ライカ
LSM800	ツァイス		共焦点顕微鏡
PBSの(10X)	ロシュ	11666789001
ティッシュテック	さくら	4583	10月
Na2HPO4	バイオフロックス	5155KG001
NaH2PO4	メルク	1,06,34,60,500
通常のヤギ血清	メルクミリポア	S26-100ミリリットル
ノーマルドンキーセラム	メルク	S30〜100ミリリットル
トリトンX-100	メルク	1,08,60,31,000
ウサギの反ムーバー	シナプス系	RRIDの番号: AB_10804285
モルモット抗シナプトフィジン	シナプス系	RRID:AB_1210382
ロバ反ウサギAF647	ジャクソン免疫研究	RRID:AB_2492288
ヤギアンチマウスAF488	ジャクソン免疫研究	RRIDの番号: AB_2337438
モヴィオル4-88	カルバイオケム	475904
ZEN2 blueソフトウェア	ツァイス		顕微鏡ソフト
フィジー	イメージJ		解析ソフトウェア
マイクロソフトエクセル	マイクロソフト