ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

1. 瞬間凍結と胸部二分法

1. 二分を開始する前に、適切な凍結保護手袋と安全メガネを着用して、デュワーフラスコに液体窒素を入れます。ブレードブレーカー、フェザーブレード、細い鉗子1組、氷、氷冷1x PBS、極低温ピンセットを入手してください。
2. 1x PBSの氷を冷たく保つためにアイスバケツを準備します。
3. ブレードブレーカーを使用してフェザーブレードを斜めにつかみ、ブレードを曲げて小さなピースを壊します。ブレードブレーカーは、小さなメスとして使用するためにブレードを所定の位置にロックできます。
   手記： 1 つのブレードがすべてのグループで持続します。刃が折れたり鈍くなったりした場合は切り替えてください。
4. P200に清潔なピペットチップを追加し、チップの1/5を取り外してサンプルを輸送します。
5. 各グループごとに新しい微量遠心チューブを準備し、各チューブに200 μLの1x PBSを加えます。この 2 本目のチューブは、最終的な DLM 調製物を収集するために使用されます。
6. パスツールピペットを使用して、チューブからすべての1x PBSを取り出します。
7. 適切な保護具を着用し、極低温ピンセットでチューブを液体窒素フラスコに10秒間沈めます
   手記： チューブが爆発しないように、チューブはしっかりと閉じる必要があります。
8. 液体窒素からチューブを取り出し、パスツールピペットで約300μLの氷冷した1x PBSをサンプルに加えます。サンプルを氷の上に保ちます。
9. シリコンエラストマーでコーティングした10 cmの解剖皿に氷冷した1x PBSを加え、改良した200 μLピペットで最初の胸部を分注します。
10. 胸部の腹側を上にして置きます。一方の手で鈍い鉗子のペアを使用して胸部を配置し、もう一方の手で細い鉗子のペアを使用して胸部神経節の一部を取り除き、胸部の正中線を露出させます。
11. 胸部の正中線を目安に、ブレードで胸部の1/3を浅く切り込みます。
12. 胸部からブレードを取り外し、鈍い鉗子で胸部を45°の角度で配置します。ブレードを再度挿入し、胸部の正中線をまっすぐに切ります。これにより、2つの半血腫が発生します。
13. 一度に1つの半胸部を取り、最も腹側線維であるDLM筋線維F(図1B)の下の余分な組織を取り除きます。ブレードを使用して慎重に1つまたは2つのカットを行い、DLMを損傷することなく余分な組織を取り除きます。
14. 分離したら、半胸部を1x PBSで正しいチューブに移します。
15. グループごとに10個の解剖された半球が作成されるまで、手順1.6-u20121.14を繰り返します。

2. 構造染色

1. 胸部サンプルを二等分した後、組織をブロッキングバッファー(0.1%正常ヤギ血清を含む1x PBS、およびpH 7.4の0.2% Triton X-100)に入れて、組織を透過化し、非特異的染色を防ぎます。パスツールピペットを使用して余分な1x PBSを除去し、各チューブに1.5 mLのブロッキングバッファーを追加します。組織を4°Cで少なくとも1時間ブロックします。
2. 蛍光標識抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ488(抗HRP-488)を希釈率1:200で、希釈率1:1000のファロイジン-647を使用して、構造染色用のサンプルを調製し、それぞれ運動ニューロンと筋肉組織を染色します。チューブあたり150μLの十分な染色を行います。染色液は、ホイルで覆った状態または暗い色の箱に4°Cで保管し、染色の準備が整うまで保管してください。
3. ブロッキング後、ガラス製のパスツールピペットで余分なブロッキングバッファーを除去します。
4. 構造染色を分配する前に、染色をボルテックスします。各チューブに150μLの染色液を加えます。サンプルをローテーターの暗い箱に室温で2時間置きます。
5. 汚れを取り除き、0.3% Triton X-100 を含む 1.5 mL の室温 1x PBS で、暗いボックス内のローテーターで 5 分間組織を 4 回洗浄します。これで、サンプルをスライドにマウントする準備が整いました。

3. ティッシュの取り付け

1. PBSTでサンプルを洗浄した後、顕微鏡スライドを調製して、染色用の組織をマウントします。ガラスカバースリップ、P200ピペット、200μLピペットチップ、はさみ、クリア補強材、ストレートエッジ鉗子、退色防止蛍光封入剤、マニキュア、スライドを覆うためのダークボックスなどの追加備品を準備します。
2. スライドにラベルを貼ってサンプルを特定し、Kimワイプで汚れを取り除きます。
3. カバースリップが半胸部サンプルを損傷しないように、補強ラベルを使用して「ブリッジ」を構築します。1つの補強ラベルを半分に切り、各半分を約15mm離して配置します。この距離は、カバースリップの幅よりも小さくする必要があります。この手順を 4 回繰り返して、5 ラベルの高さの「ブリッジ」を完成させます。
4. P200ピペットを取り、チップの1/5を切り取ってチップを修正し、サンプルをスライドに移します。サンプルは、ブリッジの中央にあるスライドに移す必要があります。
5. ラボワイプの端を取り、余分なPBSTを取り除きます。鉗子を使用して、すべてのサンプルが筋肉側を上にし、キューティクル側を下向きになるようにDLMを配置します。
6. 標準のP200ピペットチップを使用して、気泡を避けて70 μLの封入剤をスライドに塗布します。メディアを補強材の内側に円形のパターンで、外側から中心に向かって分配します。
7. 補強材の上にカバースリップを置きます。
8. マニキュアを使用して、カバーガラスの周囲の外側の端をコーティングします。組織の完全なシールを形成するためにたっぷりと適用します。
9. スライドを暗所の平らな面に置き、少なくとも10分間乾燥させ、光退色や蛍光の損失を防ぎます。スライドは、すぐにイメージングに使用したり、後で表示するために-20°Cのスライドフォルダに保存し
たりできるようになりました。

図 1:ALSのショウジョウバエモデルにおけるDLMシナプスの進行性除神経。(A)43 kDaのTar結合タンパク質(TDP-43)のヒト変異型を発現するALSトランスジェニックハエの作製を模式図に示す。(B)イラストは、成体のショウジョウバエの半胸の形と向きを描いています。このプロトコルを使用すると、HRP (緑) による運動ニューロンの構造染色とファロイジン (マゼンタ) による筋肉組織の構造染色を通じて、DLM NMJ シナプスのシナプス完全性の進行性の喪失を観察できます。私たちのモデルは、運動ニューロン(図1F-H)のヒトTDP-43M337Vから変異体を発現する成虫のハエの生成を通じて、ALSの成体モデルにおけるシナプス完全性の喪失を、筋線維CのWT(図1C-E)ハエと比較して示しています。スケールバー=63倍倍で20μm。