大規模走査型透過電子顕微鏡によるゼブラフィッシュ幼生脳損傷の検討

要約

出典:Kuipers, J. et al., Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain.J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、走査型電子顕微鏡(SEM)と透過型電子顕微鏡(TEM)の両方の要素を組み合わせて高解像度の画像を生成する技術である大規模な走査型透過型電子顕微鏡(STEM)を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の脳損傷を調査する方法を示しています。サンプルの準備と、脳損傷を特定するための高解像度STEM画像の取得に必要な手順を概説しています。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 固定と埋め込み
   1. 固定
      1. E3(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO_4、10 mM HEPES、pH 7.6)ゼブラフィッシュ水に添加したトリカイン(0.003%)で魚の幼生を麻酔し、動きが検出されなくなるまで解剖顕微鏡で200 μLのピペットチップを優しくつつくことで麻酔の深さをテストします(図1A)。
      2. 記載されているように1.8%アガロースで共焦点または2光子イメージングを使用してin vivoイメージングデータを取得した後、相関電子顕微鏡(EM)用のサンプルを処理する場合は、Triton-X-100(0.05%)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して幼虫をアガロースに固定します。
      3. アガロースから幼虫を切断し、大規模EMに加工します。
      4. Triton-X-100(0.05%)を含むPBS中の新鮮な4%パラホルムアルデヒドに幼虫をプラスチックチューブ内の室温で2時間固定します
         手記：培養(in vitro)で増殖した細胞は、次のステップ(1.1.1.5)で説明するように、グルタルアルデヒドに直接固定できます。
      5. 溶液を取り出し、0.5% PFA、2% グルタルアルデヒド (GA)、および 0.1 M カコジル酸ナトリウム (pH 7.4) 100 μL を加えます。4°Cで一晩保存し、0.1 Mカコジル酸ナトリウムでサンプルを2回すすぎます。
      6. 幼虫の頭を後脳に向けて吻側に切り取り、オスミウムの浸透を促進します。細い注射器/鉗子を使用してください。
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      7. %四酸化オスミウム(OsO₄)/1.5%フェロシアン化カリウム(K₄[Fe(CN)₆])の幼虫を0.1 Mカコジル酸ナトリウムで氷上で2時間後置し、再蒸留H₂Oで3 x 5分間すすぎます。
      8. エタノール濃度の増加(50%、70%、100%の3倍)で20分間のインキュベーションにより、エタノール中で脱水します。
   2. 埋め込み
      1. EMラボで使用される標準的なレシピに従ってエポキシ樹脂を準備します.
         手記：エポキシ樹脂は、グリシドエーテル10019.8g、2-ドデセニルコハク酸無水物9.6g、無水メチルナジン11.4gをマグネチックスターラーで混合します。DMP-30(トリス(ジメチルアミノメチル)フェノール)0.5gを加え、再度混合します。
      2. 回転(RT)しながら、エタノール(v / v)中の50%エポキシ樹脂で幼虫を一晩インキュベートします。
      3. 希釈したエポキシ樹脂を純粋な樹脂に交換します。30分間インキュベートし、再び新鮮な樹脂を加えてさらに30分間インキュベートします。再度、樹脂をリフレッシュし、室温で3時間インキュベートし、続いて58°Cで15分間インキュベートし、さらに室温で低圧(200 mbar)で1時間インキュベー
      トします。
      4. 必要に応じて、針またはつまようじを使用して、解剖顕微鏡で市販のシリコンフラット埋め込み型にヘッドを向けます(図1B)。
      5. エポキシ樹脂を58°Cで一晩重合します。エポキシ樹脂がまだ柔らかすぎる場合は、もう1日かけて58°Cで重合して硬化させます。これによりくぼみが簡単に残る場合は、さらに1日かけて重合し、58°Cで硬化させます。試験片が完全に硬化したら、トリミングと切片作成に進みます。
      6. カミソリの刃を使って、スタブから余分な樹脂を取り除きます(図1B)。
2. セクショニング、コントラスト、および取り付け
   1. セクショニング
      1. 超ミクロトームを使用したエポキシ樹脂ブロックのセクション。
      2. ガラスナイフまたはダイヤモンドヒストナイフを使用して、トルイジンブルー/塩基性フクシン(図1D)染色用の半薄切片(500 nm)を切断し、正しい位置を検出します。
      3. 微細なスライド上の半薄切片を、炎で溶かして先端を閉じたガラス製のパスツールピペットで拾い上げて移します。ホットプレートで水がなくなるまで乾かします。ホットプレート上で1%トルイジンブルーを水に溶かして10秒間染色し、水ですすいだ後、1%四ホウ酸ナトリウム中の0.05%塩基性フクシンで10秒間染色します。通常の光学顕微鏡で10倍から40倍で調べます。
      4. 脳内の適切な部位/向きに到達したら、ダイヤモンドナイフでエポキシ樹脂ブロックを切片化し続け、極薄切片(~70 nm;図1E)
      5. 嗅孔、目、灰白質の境界など、脳内およびその周辺で容易に識別できる解剖学的構造を使用して、極薄切片作成中に関心領域を特定し、サンプルを傾けたときに切片化角度を調整します。
      6. セクションをシングルスロットL2 x 1銅グリッド(図1F)に取り付けて、グリッドバーによって中断されずに取得できるようにします。Formvarコーティングされたグリッドを使用して、セクションをサポートします。
   2. 対照的な
      1. グリッド上の極薄切片を2%酢酸ウラニルのメタノール溶液で2分間染色し、続いてクエン酸レイノルズ鉛でさらに2分間染色します。

2. 画像取得

1. 大規模走査型透過電子顕微鏡(STEM)
   手記：スキャニングEMと外部スキャンジェネレータを使用して、STEM検出を使用して複数の大きな視野を高解像度で取得できます。通常、この方法で生成された1つの画像は、~100枚の透過型電子顕微鏡(TEM)画像の視野に相当し、スティッチングの量を大幅に削減します。
   1. 顕微鏡へのサンプルの埋込み
      1. セクションのあるグリッドをマルチグリッドサンプルホルダーに置き、SEMのチャンバーに移します。
   2. STEM検出器のアライメント
      1. サンプルの入ったグリッドをビームの下に置き、レンズポールから約5mm離れるように上に移動します。インレンズ検出器を使用して20kVで画像を取得します。
      2. グリッドエッジに焦点を合わせ、作動距離を4.0mmに調整します。
      3. サンプルホルダーを安全な位置に移動し、STEM検出器を運び込みます。
      4. STEM検出器の穴を像像像の中央に合わせ、レンズ内検出器で最高速度で撮像しながら調整ネジを回します。
      5. レンズポールと検出器の間にちょうど収まるサンプルホルダーを慎重に戻します。
      6. インレンズ検出器で画像を取得し、画像がセクション領域にあることを確認します。
      7. STEM検出に切り替え(ゲイン中、すべての象限を「マイナス」に設定)、画像を取得し、スキャンする領域を選択します。
      8. 加速電圧を21kVまで上げてビームが安定するのを待ち(再び安定した画像)、その後2kV刻みで29kVまで下げます。
   3. 画像の取得
      1. (電子ビームによる明るさの変化を防ぐため)スキャンする領域全体が画像ウィンドウに収まるようにズームアウトして、サンプルに事前に照射します。
      2. アパーチャを120μmに変更します(適切なダイナミックレンジを維持するには、検出器のゲインを1ステップ減らす必要があります)。
      3. ピントをぼかして画像がぼやけます。
      4. 縮小領域スキャンオプションを使用して、スキャン領域をできるだけタイトにします。
      5. フレームが約1〜2秒でスキャンされるようにスキャン速度を設定します.
         手記：サイズと組織にもよりますが、通常、これには1/2時間(100 x 100 μmの視野(FOV))から最大3時間(1,000 x 500 μm)かかります。
      6. 少なくとも100倍ズームインし、小さな領域を10秒間スキャンします
         手記：この領域が周囲に比べて明るさに変化しない場合は、事前の照射で十分です。
      7. 30 μmの絞りを戻します(および中程度のSTEMゲイン)。
      8. サンプルに注目します。
      9. ウォブラーを使用して絞りを合わせます(倍率~40,000倍)。
      10. ピントが合っている間に、最も明るい領域/特徴を選択し、詳細が見えるようにスキャン速度を設定します。
      11. 顕微鏡ソフトウェアで、ヒストグラムを注意深く観察して明るさとコントラストを調整し、すべてのピクセルがダイナミックレンジ内に収まるようにします。最も暗い領域/機能についても同じことを行います。
      12. 明るいエリアに戻って、もう一度確認してください。ヒストグラムの両側にスペースが空くように、安全側にしてください。
      13. スキャンする領域全体がイメージングウィンドウに収まるようにズームアウトし、大領域取得プログラムを開始します。
      14. ウィザードのオプションを使用して、画面から領域を選択してモザイクを設定します。必要な詳細に応じて、ピクセルサイズ2〜5nmを使用します。STEMには滞留時間3μsを使用します。
      15. 「前のタイルにオートフォーカス」オプションを選択し、デフォルトの会社設定で大規模取得ソフトウェアのオートフォーカスを使用し、「実行前に設定を確認する」チェックボックスをオンにして、データを保存する場所を定義します。
      16. 「最適化」を押して顕微鏡の設定を確認します.
          手記：これで、必要な時間が表示されます。これは、1 x 0.5 mm の領域で最大 72 時間になる場合があります。
      17. ウィンドウでは、「最大タイル解像度」に 20,000 を入力して、個々のタイルが 20k x 20k を超えないようにし、鈍いエッジ効果を防ぎます。「実行」を押します。
      18. フォーカスと明るさ/コントラスト(B / C)の確認を求められた場合は、外部スキャンジェネレーターをオフにし、顕微鏡ソフトウェアでフォーカスと非点収差を慎重に調整します。B/C.
          は変更しないでください 手記：ステージを移動したり、倍率を変更したりすることはできますが、倍率は目的のピクセルサイズに戻す必要があります。
      19. 外部スキャンジェネレータを再度オンにして、「続行」を押します。

結果

図1:ゼブラフィッシュの脳に対する大規模組織電子顕微鏡のワークフロー。(ア)生後7日齢のゼブラフィッシュの幼生 (B) ゼブラフィッシュの幼生の頭部をエポキシ樹脂に横に埋め込んだもの。 (C)試料の半薄切片化と配向のためのガラスナイフ (D)2匹のゼブラフィッシュの幼生が横に並んで埋め込まれた代表的な半薄トルイジンブルー染色切片 (E)極薄(70nm)切片を切断するダイヤモンドナイフ (F)(D)のゼブラフィッシュ幼生全体の脳切片を1穴グリッド上に編集した画像。 (G) 本研究で大規模2次元電子顕微鏡に用いた顕微鏡システム。 (H)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
化学薬品
低融点アガロース	VWRの	444152グラム
トリカイン	シグマ	E10521
トリトン - X-100	シグマ	X100
グルタルアルデヒド	ポリサイエンス	1909
カコジル酸ナトリウム	シグマ	C0250
テトロキシドオスミウム	電子顕微鏡科学	19114
カリウムフェロシアン化物 (K4[Fe(CN)]6)	メルク	4984
エタノール	VWRの	20821.365
酢酸ウラニル	メルク	8473
四ホウ酸ナトリウム	メルク	1063808
トルドイディーンブルー	メルク	1273
ベーシックフクシン	BDHの	340324
クエン酸鉛	BDHの	中止
エポン
2-ドデセニルコハク酸無水物	セルバ	20755
無水メチルナディ	セルバ	29452
グリシドエーテル100	セルバ	21045
DMP-30	ポリサイエンス	553
標準フラットエンベッディングモールド	電子顕微鏡科学	70901
ダイヤモンドナイフ	株式会社Diatome
銅グリッド	電子顕微鏡科学
両面カーボンテープ	電子顕微鏡科学
スキャニングEM Zeiss Supra55	ツァイス
ウルトラミクロトーム Leica EM UC7	ライカ
Atlas外部スキャンジェネレータ	フィビクス

年 年 名 名 ク 名