ヒト胚性幹細胞の神経オルガノイドへの分化と成熟

要約

出典:Cosset, E., et al.脳腫瘍および神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、ヒト胚性幹細胞を神経オルガノイドにするための段階的なプロトコールが示されています。この方法では、ニューロンのロゼット形成を誘導し、その後、疎水性膜上で制御された成熟と最終培養を行い、完全に発達した神経オルガノイドを達成します。

プロトコル

1. 未分化ヒト胚性幹細胞(hESC)の維持と培養

1. フィーダーフリー条件でhSECの維持と増殖を行うには、特定の細胞外マトリックスでディッシュをプレコーティングします。
   1. 300 μLの細胞外マトリックスを4°Cで解凍し(標準濃度18-22 mg/mL、氷上に保つ)、15 mLの冷たいDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium )培地と穏やかに混合して、細胞外マトリックスの早期ゲル化を回避します。7.5 mLの細胞外マトリックスを両方のT150フラスコに加えます。
   2. 細胞外マトリックスでコーティングした皿を37°Cで少なくとも1時間(最大一晩)インキュベー
   トします。
   3. 培地と種子のhESCを6.5 x 104細胞/cm²の密度で取り出します。
2. H1(hESC細胞株)をhESC培地および1%ペニシリン/ストレプトマイシンに保持します。
3. 酵素手順で細胞を通過させます:7.5 mLの酵素溶液をT75 cm2フラスコに37°Cで1〜2分間加えます。細胞が完全に剥離したら、7.5 mLのDMEM-F12を加え、300 x gで5分間遠心分離します。生存率を向上させるには、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(10 μM)を含む同じ培地で、細胞を所望の密度で細胞外マトリックスコーティング皿に再播種し、24時間放置します。

2. hESC由来神経オルガノイド

1. 3D培養を開始する24時間前に、hESC培地を10 μM ROCK阻害剤を添加した無血清培地と交換します(どちらの成分も、マイクロウェルプレートの凝集期における細胞の生存と自発的なニューロスフェア形成をサポートするために必要です)。細胞は60%のコンフルエント度にあるべきです。翌日(0日目)に、hESCコロニーを単一細胞として分離します:培地を取り出し、Ca²⁺/Mg²⁺を含まないPBSですすぎ、5 mLの酵素溶解溶液を加え、37°Cで1〜2分間インキュベー
トします。
2. 10 μMのROCK阻害剤を添加した無血清培地に細胞を収集し、300 x gで5分間遠心分離します。上清を除去し、10 μMのROCK阻害剤を添加した10 mLの無血清培地で細胞をカウントします。
3. 並行して、マイクロウェルプレートをウェルあたり2 mLの無血清培地ですすぎ、プレートを1200 x gで5分間遠心分離してすべての気泡を除去し、ニューロスフェアの形成を防ぐことができます。
4. 10 μM ROCK阻害剤を添加した12.5 mLの無血清培地に28.2 x 10⁶個の細胞を調製します。1000細胞/マイクロウェルを分注します。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩(最大36時間)置きます。例えば、30個のヒト神経オルガノイドを得るためには、1つのT150フラスコをコンフルエンス(約3000万細胞)の70%〜80%で使用します。
5. 翌日(1日目)に球体を(P1000で)集め、6ウェルプレートに入れます。各ウェルに、2 mLのB27培地とDMEM-F12 GlutaMAXおよびNeurobasal培地(1:1で混合)を加え、1% B27サプリメントと1%非必須アミノ酸(NEAA)を添加します。迅速な神経誘導を促進するために、10 μM TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/Activin/Nodal 阻害剤と 0.5 μM 骨形態形成タンパク質 (BMP) 阻害剤で構成されるデュアル SMAD (Sma and Mad Related Protein) 阻害カクテルを培地に補給します。このステップから、球体は回転(60 rpm、オービタルシェーカー)で培養されます。回転は、球が互いにくっついたり、プレートにくっついたりするのを防ぐために重要です。
6. 2〜3日ごとに培地を交換します:プレートを曲げて球体を5分間落下させ、培地の半分(2 mL)を取り除き、成長因子と阻害剤を添加した新鮮なB27培地を2mL追加します。球体を遠心分離しないでください。
7. 次の時間経過に従って神経誘導を実行します。
   1. 1〜4日目から、デュアルSMADを添加したB27培地で球体を培養します。デュアルSMAD阻害カクテル(10 μM TGFβ/アクチビン/ノード阻害剤および0.5 μM BMP阻害剤)は、神経誘導を促進します。
   2. 4 日目から 11 日目まで、10 ng/mL の上皮成長因子 (EGF) と 10 ng/mL の基本性線維芽細胞因子 (bFGF) を B27 培地に追加し、デュアル SMAD カクテルを添加することにより、hESC 由来の神経ロゼットの増殖を促進します。
      手記：11日目には、ほとんどの細胞がネスチン陽性であるはずです。
   3. 11〜13日目から、0.5μMのBMP阻害剤を添加したB27培地で球体を培養します。
   4. 13 日目から 21 日目まで、10 ng/mL グリア由来神経栄養因子 (GDNF)、10 ng/mL 脳由来神経栄養因子 (BDNF)、および 1 μM の γ-セクレターゼ阻害剤を補給した B27 培地で球体を培養します。GDNFとBDNFは、ニューロンとグリアの分化を促進します。γ-セクレターゼ阻害剤は、神経の成熟度を高めます。
   5. 21日目に、球体(約1,000球)を親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜(直径6 mm、0.4 μm)にプレート化し、6ウェルプレート用に設計された培養プレートインサートにプレートします。このステップから回転を停止します。明視野顕微鏡で観察されたロゼットの存在は、神経分化の開始を示しています。神経ロゼットは、PTFE膜に球体をめっきしてから2〜3日後に観察できます。
   6. 成長因子と阻害剤(下記参照)を添加したB27培地1mLを、メンブレンインサートの下の各ウェルに2〜3日ごと(通常は月曜日、水曜日、金曜日)に、次の3週間の分化のために追加します。
   7. 21〜25日目から、同じ神経成熟培地でヒト神経オルガノイドを培養します。
   8. 25〜28日目まで、B27培地のみを1μM γセクレターゼ阻害剤で補体します。
   9. 28-39日目から、γ-セクレターゼ阻害剤の追加を停止し、B27培地でのみヒト神経オルガノイド培養を続けます.
      手記：3週間後、神経オルガノイドはGIC移植に使用できるようになります。神経の成熟に伴い、神経未熟マーカーNestinの減少と成熟神経マーカーβ3-tubulinおよびGFAPの増加が観察された。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート(6ウェルプレート)	ファルコン / コーニング	07-201-588
Aggrewell 400 (マイクロウェル培養プレート)	StemCellテクノロジー	34421
B27サプリメント(B27)	ライフテクノロジー / Invitrogen	1238	どちらのプロトコルでも、ストック溶液100倍、最終溶液1倍
脳由来神経栄養因子(BDNF)	セルガイダンス	GFH1-2	どちらのプロトコルでも、純粋なH2Oに100 μg/mLの原液、最終溶液20 ng/mLをストック
化合物E、γ-セクレターゼ阻害剤(γ-セクレターゼ阻害剤)	カルバイオケム	CASの209986-17-4	両方のプロトコル(γ-セクレターゼ阻害剤XXI)について、DMSO中のストック溶液5 mM、最終溶液1 μM
ジメチルスルホキシドピュア(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	C6164	コンパウンド溶剤、すぐに使用可能
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	ライフテクノロジー	12491-015	細胞培養に、すぐに使用できます
ダルベッコの変性イーグルミディアムミックスF-12(DMEM-F12)	ギブコ	11320033	細胞培養に、すぐに使用できます
EDTA 0.1 mM (EDTA)	ライフテクノロジー	AM9912	細胞培養に、すぐに使用できます
グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)	セルガイダンス	GFH2-2	どちらのプロトコルでも、純粋なH2Oに100 μg/mLの原液、最終溶液20 ng/mLをストック
親水性ポリテトラフルオロエチレンメンブレン(PTFEメンブレン)	バイオセルインターフェース	中止
LDN-193189(BMP阻害剤)	Axon Medchem /ステムゲン	04-0072-02/1509	デュアル/Smad、DMSO溶液5 mM、最終溶液0.5 μM
L-グルタミン(L-グルタミン)	ギブコ	25030081	L-グルタミン(200mM)、原液200mM、最終液2mM
マトリゲル(細胞外マトリックス)	BDバイオサイエンス	354277	hESC認定マトリックス、原液18-22 mg/mL、最終溶液180-220 μg/mL
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 μm) (カルチャープレートインサート)	ミリポア	PICM03050
モノクローナル抗β-チューブリンIII抗体	シグマ	T8660	1/1000希釈
MSオービタルシェーカー、MS-NOR-30(オービタルシェーカー)	専攻科学	MS-NRC-30
ニューロベース(Neurobasal)	ライフテクノロジーズ / Gibco	21103049	維持および成熟胚性ニューロン細胞集団、すぐに使用可能
非必須アミノ酸(NEAA)	ギブコ	11140	非必須アミノ酸100倍、原液100倍、最終液1倍
Nurr1 抗体 (M-196)	サンタクルス	SC-5568	1/100希釈
ニュートリステム(hESC培地)	バイオ産業	05-100-1A	幹細胞培地、すぐに使用可能
ペニシリン/ストレプトマイシン(ペニシリン/ストレプトマイシン)	ライフテクノロジーズ / Gibco	15140122	細胞培養用は、原液5mg/mL、最終液50μg/mL
Ca2+/Mg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+/Mg2+を含まないPBS)	ライフテクノロジー	14190250	細胞培養に、すぐに使用できます
Rho関連キナーゼ Y-27632 (ROCK)	アブカム・バイオケミカルズ	AB120129から1	岩石阻害剤、DMSO溶液50 mM原液、最終溶液10 μM
SB-431542 (TGFβ/アクチビン/節点阻害剤)	上り坂	ASC- 163	Dual-Smad、DMSO に 50 mM のストック溶液、最終溶液 10 μM
StemPro Accutase(hESC酵素溶液)	ギブコ	A11105-01	hESC酵素溶液、すぐに使用可能
T150フラスコ(T150フラスコ)	隼	08-772-1F
トランスフォーミング成長因子β3(TGFβ3)	セルガイダンス	GFH109-2	ドーパミン作動性プロトコルの場合、純エタノール中の溶液100μg / mLをストックし、最終溶液1 ng / mLをストック
トリプシン0.25%(酵素溶液)	ライフテクノロジー	15050065	酵素溶液、すぐに使用可能
X-vivo(無血清培地)	ロンザ	BE04-743Q	セラムフリーミディアム、準備ができました