ヒト胚性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンオルガノイドの作製

要約

出典: Cosset, E. et al. Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、パーキンソン病を研究するためのモデルを提供するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)のドーパミン作動性ニューロンへの分化を示しています。hESCは、マイクロウェルプレート内の神経誘導培地で培養され、3Dニューロスフェアが形成されます。次に、これらを神経誘導培地で培養して、ドーパミン作動性前駆ニューロンへの分化を促進します。ニューロンの最終的な成熟は、気液界面条件下で培養インサートで起こり、成熟したドーパミン作動性ニューロンからなる3Dオルガノイドが得られます。

プロトコル

1. パーキンソン病(PD)研究のためのhESC由来ドーパミン作動性オルガノイド

1. 0日目:2D培養でhESCを最大60%のコンフルエントまで増幅し(0日目)、その後、hESCの多能性特性を維持するために使用した幹細胞培地を無血清培地に置き換えます。0.5 μMの骨形成タンパク質(BMP)阻害剤と10 μMのトランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン/ノード阻害剤(デュアルSMAD阻害カクテル)を培地に添加して神経誘導を開始し、次に10 μMのRho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を24時間添加して、継代中の細胞の生存率を高めます。
2. 1日目:0.5 μM BMP阻害剤、10 μM TGFβ/Activin/Nodal阻害剤、および10 μM ROCK阻害剤を添加した無血清培地のウェルあたり2.5 mLでマイクロウェルプレートを調製します。神経管の腹側パターンに向かう細胞を特定するには、100 ng/mL ソニックヘッジホッグ(SHH)、100 ng/mL 線維芽細胞成長因子 8(FGF8)、および 2 μM の平滑化アゴニストを追加します。プレート(培地および細胞なし)を1200 x gで5分間遠心分離し、マイクロウェルから気泡を除去します。
   1. 2Dでの神経誘導を1日間行った後、培地を取り出し、Ca²⁺/MgCl²⁺を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で迅速に洗浄します。T75 cm²フラスコに7.5 mLの組換え酵素溶液を添加して、単一細胞懸濁液中のコロニーを解離します。37°Cで2分間インキュベートした後、7.5 mLのダルベッコ改変Eagle培地/栄養混合物F-12(DMEM-F12)を添加してインキュベートします。
   2. 細胞懸濁液を回収し、300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、マイクロウェルプレートの調製に使用したのと同じ培地中の細胞をカウントします。
   3. 培地の容量を調整して、マイクロウェルあたり1000個の細胞を含むニューロスフェアを形成することを可能にする細胞懸濁液を得る(例えば、ここで使用するマイクロウェルプレートは、ウェルあたり4,700個のマイクロウェルを含む)。そこで、2.5mLの培地に470万個の細胞を調製し、プレートにすでに置いた前の2.5mLの培地に加えます。
   4. 各マイクロウェルに細胞を正しく分布させるには、プレートを静かに振とうし、マイクロウェルプレートを300 x gで5分間遠心分離し、プレートを37°Cで24時間インキュベートして球体を生成します。
3. 2日目:マイクロウェルを培地で静かに洗い流し、組織処理した6ウェルプレートで球体を回収し、移します。培地を、1% B27、1x 非必須アミノ酸 (NEAA)、2 mM L-グルタミン、および 1% のペニシリン/ストレプトマイシンを補充した神経基礎培地と交換します。さらに、地域化因子SHH、FGF8、平滑化アゴニスト、およびデュアルSMAD阻害小分子を追加します。
   1. 球体を37°C(60 rpm、オービタルシェーカー)で回転させ、2〜3日ごとに新たに補充した半媒体を交換します。
4. 3日目:神経誘導を強化し、中脳同一性を持つ神経前駆細胞に変換するために、Wnt/β-カテニン経路を活性化する3μMグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3ベータ(GSK-3β)阻害剤を培地に補給します。GSK-3β阻害剤を13日目まで培地に維持します。2つの新しい組織処理された6ウェルプレートに分割して、ウェルあたりの球密度を減らし、球の凝集を回避します.
   手記：8日目には、ほとんどの細胞がネスチン陽性であるはずです。
5. 8日目:神経成熟の開始:領域化因子SHH、FGF8、平滑化アゴニスト、およびデュアルSMAD阻害カクテルを0.5 mMジブチリル環状アデノシン一リン酸(cAMP)(成熟を促進するため)、20 nMヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(細胞周期終了用)、1 μM γ-セクレターゼ阻害剤および成長因子、10 ng / mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、 10 ng/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)、1 ng/mLのトランスフォーミング成長因子β3(TGFβ3)、および5 ng/mLの線維芽細胞成長因子20(FGF20)(どちらもドーパミン作動性[DA]前駆細胞の生存に有利)。2〜3日ごとに媒体を交換してください。
6. 21日目:神経オルガノイドを作製します:ポリテトラフルオロエチレン(PTFE膜、直径6mm)上の気液界面条件下で約100個のニューロスフェアを播種します。メンブレンを培養プレートインサート(0.4 mm)に移し、前述のようにニューロスフェア分化に使用した神経成熟培地1.2 mLを添加します。
   1. このステップから回転を停止します。必要な差別化の時点が達成されるまで、2〜3日ごとに培地を交換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート(6ウェルプレート)	ファルコン / コーニング	07-201-588
Aggrewell 400 (マイクロウェル培養プレート)	StemCellテクノロジー	34421
B27サプリメント(B27)	ライフテクノロジー / Invitrogen	1238	どちらのプロトコルでも、ストック溶液100倍、最終溶液1倍
脳由来神経栄養因子(BDNF)	セルガイダンス	GFH1-2	どちらのプロトコルでも、純粋なH2Oに100 μg/mLの原液、最終溶液20 ng/mLをストック
CHIR-99021(GSK-3β阻害剤)	軸索メドケム	CT99021	ドーパミン作動性プロトコールの場合、DMSO中のストック溶液7.5 mM、最終溶液3 μM
化合物E、γ-セクレターゼ阻害剤(γ-セクレターゼ阻害剤)	カルバイオケム	CASの209986-17-4	両方のプロトコル(γ-セクレターゼ阻害剤XXI)について、DMSO中のストック溶液5 mM、最終溶液1 μM
ジブチリル環状-AMP(ジブチリルcAMP)	シグマ	D0627	ドーパミン作動性プロトコルの場合、DMSO中のストック溶液0.5 M、最終溶液0.5 mM
ダルベッコの変性イーグルミディアムミックスF-12(DMEM-F12)	ギブコ	11320033	細胞培養に、すぐに使用できます
EDTA 0.1 mM (EDTA)	ライフテクノロジー	AM9912	細胞培養に、すぐに使用できます
線維芽細胞成長因子20(FGF20)	ペプロテック	100〜41	ドーパミン作動性プロトコールの場合、純粋なH2Oに溶液100 μg/mLをストックし、最終溶液を5 ng/mL
線維芽細胞成長因子8(FGF8)	ペプロテック	GFH176-5	ドーパミン作動性プロトコルの場合、純粋なH2O中のストック溶液100μg / mL、最終溶液100 ng / mL
グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)	セルガイダンス	GFH2-2	どちらのプロトコルでも、純粋なH2Oに100 μg/mLの原液、最終溶液20 ng/mLをストック
親水性ポリテトラフルオロエチレンメンブレン(PTFEメンブレン)	バイオセルインターフェース	中止
LDN-193189(BMP阻害剤)	Axon Medchem /ステムゲン	04-0072-02/1509	デュアル/Smad、DMSO溶液5 mM、最終溶液0.5 μM
L-グルタミン(L-グルタミン)	ギブコ	25030081	L-グルタミン(200mM)、原液200mM、最終液2mM
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 μm) (カルチャープレートインサート)	ミリポア	PICM03050
MSオービタルシェーカー、MS-NOR-30(オービタルシェーカー)	専攻科学	MS-NRC-30
N2サプリメント(N2)	インビトゲン	17502-048	GIC培養の場合、原液100倍、最終液1倍
ニューロベース(Neurobasal)	ライフテクノロジーズ / Gibco	21103049	維持および成熟胚性ニューロン細胞集団、すぐに使用可能
非必須アミノ酸(NEAA)	ギブコ	11140	非必須アミノ酸100倍、原液100倍、最終液1倍
ニュートリステム(hESC培地)	バイオ産業	05-100-1A	幹細胞培地、すぐに使用可能
ペニシリン/ストレプトマイシン(ペニシリン/ストレプトマイシン)	ライフテクノロジーズ / Gibco	15140122	細胞培養用は、原液5mg/mL、最終液50μg/mL
Ca2+/Mg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+/Mg2+を含まないPBS)	ライフテクノロジー	14190250	細胞培養に、すぐに使用できます
プルモルファミン(平滑化アゴニスト)	カルバイオケム	SML0868	ドーパミン作動性プロトコルの場合、DMSOに10 mMをストック溶液、最終溶液2 μM
Rho関連キナーゼ Y-27632 (ROCK)	アブカム・バイオケミカルズ	AB120129から1	岩石阻害剤、DMSO溶液50 mM原液、最終溶液10 μM
SB-431542 (TGFβ/アクチビン/節点阻害剤)	上り坂	ASC- 163	Dual-Smad、DMSO に 50 mM のストック溶液、最終溶液 10 μM
ソニック・ヘッジホッグ (SHH)	セルガイダンス	GFH168-5	ドーパミン作動性プロトコルの場合、純粋なH2O中のストック溶液100μg / mL、最終溶液100 ng / mL
StemPro Accutase(hESC酵素溶液)	ギブコ	A11105-01	hESC酵素溶液、すぐに使用可能
T150フラスコ(T150フラスコ)	隼	08-772-1F
トランスフォーミング成長因子β3(TGFβ3)	セルガイダンス	GFH109-2	ドーパミン作動性プロトコルの場合、純エタノール中の溶液100μg / mLをストックし、最終溶液1 ng / mLをストック
トリコスタチンA(ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤)	シグマ	T8552	ドーパミン作動性プロトコールの場合、DMSOに100μMをストック溶液、最終溶液20 nM
TrypLE(組換え酵素溶液)	インビトゲン	12604021	組換え酵素溶液、すぐに使用可能
トリプシン0.25%(酵素溶液)	ライフテクノロジー	15050065	酵素溶液、すぐに使用可能
X-vivo(無血清培地)	ロンザ	BE04-743Q	無血清培地、すぐに使用可能

名 します。 の にします。 します。 します。