インパクタープローブを用いた外傷性脳損傷マウスモデルの生成

Abstract

出典: Furmanski, O., et al. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオは、マウスに頭蓋骨の開放性外傷性脳損傷を誘発する手順を示しています。これは、頭蓋骨の正中線切開を行い、頭蓋骨をドリルで穴を開けて骨皮弁を取り外して脳皮質を露出させ、高圧を加えて外傷を誘発する方法を示しています。次に、創傷を縫合して、その後の実験のためにマウスモデルを準備します。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 頭蓋切除術と皮質衝撃の制御

1. 制御された皮質衝撃装置および外科用品の準備。
   1. 創傷洗浄のために、1 mLのスリップチップシリンジに0.5 mLの滅菌生理食塩水を入れます。.25Gの針をシリンジに取り付けて、灌漑を制御します。
   2. ジメチルスルホキシド(DMSO)中のシクロスポリンA(CsA)の希薄溶液を調製し、最終濃度1 mg / mLにします。.2 つ目の 1 mL スリップチップシリンジに 0.5 mL の CsA 溶液をロードして免疫抑制します。25G以上の針をCsAシリンジに取り付けます。
   3. 制御された皮質インパクトピストンを定位固定装置フレームのアームに取り付け、15°の角度にセットします。3mmインパクタープローブをピストンに取り付けます。
   4. 衝撃の速度を 1.5 m/s に、衝撃の滞留時間を 0.1 秒に設定すると、軽度の皮質損傷が生じます。
2. 片側頭蓋切除術を行う
   1. マウスを、圧縮酸素源を備えたイソフルラン気化器に接続された麻酔誘導チャンバーに入れます。~0.7 L/min の酸素で ~3% イソフルランで麻酔を誘発します。つま先のつま先つまみに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
   2. 電動バリカンで頭皮を剃り、抜け落ちた毛皮を拭き取ります。
   3. マウスを、麻酔薬送達用ノーズコーンが取り付けられた定位固定フレームに置きます。
      1. マウスの下の脳定位固定装置フレームに37°Cのウォーミングパッドを装着し、麻酔下で体温を維持します。イヤーバーとバイトバーで頭を固定し、頭蓋骨の前頭骨が水平になるように頭を向けます。手術期間中、麻酔を ~1.5%-2% イソフルランに維持します。
   4. 術前ケアと無菌手術の準備を行うには、滅菌綿棒を使用して抗生物質眼科用軟膏を目に塗布します。剃毛した頭皮部分にヨウ素ベースの溶液を塗布します。これを70%エタノールで取り除きます。頭のてっぺんが見えるように、動物を穴あき手術用ドレープで覆いますが、目は覆われています。
   5. メスやハサミを使って頭皮に正中線切開(1.5-2cm)をします。滅菌綿棒を使用して傷口をきれいにし、ブレグマの正中線の左側の筋膜を取り除きます。
   6. インパクタープローブを使用して、頭蓋切除部位を特定します。
      1. 定位基準点(X = 0、Y = 0)をbregmaに設定します。プローブを正中線から2mm左に横方向に調整します。細い先端の外科的に安全なマーカーを使用して、プローブの周りに直径5mmの円の輪郭を描きます。インパクターを持ち上げて回転させ、位置を外します。
   7. 高速ロータリーマイクロモーターキットハンドツールを使用して、丸い先端の0.6mmまたは0.8mmのバリドリルビットを使用して、最大速度70%~80%で頭蓋骨に穴を開けます。頭蓋骨に軽い圧力をかけながら、5 mmの円周方向の輪郭に沿って穴を開けて、この境界を薄くします。
      1. 穴あけ中に過度の圧力をかけないでください。振動、圧縮、または偶発的な貫通は、皮質損傷を引き起こす可能性があります。代わりに、ドリルビットの速度で作業を行います。
      2. 頭蓋骨の過度の摩擦加熱を避けるために、特定の場所に長時間穴を開けないでください。頭蓋切除術を滅菌生理食塩水で時々洗浄して、破片を取り除き、回転工具からの加熱を減らします。
      3. 冠状縫合線に穴を開けるときは、これらのポイントが出血しやすいため、細心の注意を払ってください。
   8. 頭蓋骨切除術の輪郭が十分に薄くなったら、細いピンセットを使用して頭蓋骨のフラップを取り外します。フラップを内側でつかみ、放射状にゆっくりと持ち上げて横方向に引っ張ります。
      1. フラップを持ち上げるときは硬膜を傷つけないでください。重傷を負ったり、出血の原因となることがあります。
3. 軽度の制御された皮質衝撃損傷を行う
   1. インパクタープローブを滅菌アルコール調製パッドで洗浄します。インパクタープローブを露出した皮質上の位置に戻します。プローブが硬膜の表面に触れるまでプローブを下げます。この位置を Z = 0 としてマークします。
   2. ピストンを引っ込めてZ = -1.0 mmに移動し、ピストンを吐き出して皮質に衝撃を与えます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mlシリンジ	ベクトン・ディキンソン (BD)	309659
25Gプレシジョングライドシリンジニードル	ベクトン・ディキンソン (BD)	305122
麻酔気化器	ヴェトランド	0521-11-22
動物ハンドリングクロス			百貨店での購入
ベタジン	パデュー製品	NDC-67618-151-32
圧縮酸素			選択可能な製品; 地域によって異なります
シクロスポリンA	シグマ・アルドリッチ	30024-100ミリグラム
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D8418-500ミリリットル
DMEM	Invitrogen (サーモフィッシャー)	A14430-01
細いピンセット	ファインサイエンスツール	11254から20
鉗子	ファインサイエンスツール	91106から12
高速ロータリーマイクロモーターキット	フォアダムエレクトリック株式会社	K.1070 - K.107018
理想のマイクロドリルバリ5個セット	セルポイントサイエンティフィック	60〜1000
Impact CCI用脳定位固定装置1個	ライカバイオシステムズ	39463920
眼科用軟膏	ファルコン・ファーマシューティカル	NDC-61314-631-36
小さなげっ歯類の定位固定装置フレーム	ストールティング	51925
小さなハサミ	ファインサイエンスツール	14060から09
滅菌アルコール調製パッド	フィッシャーブランド	06-669-62
滅菌綿棒/ケンダルQチップ	タイコヘルスケア	540500
滅菌生理食塩水	ホスピーラ	NDC-0409-1966-07
縫合糸 - 湾曲した針と5.0シルク	オアシス	MV-682