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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 動脈カテーテル法
- ケタミンとキシラジンの腹腔内注射と、局所的な実践による鎮痛薬(例:.、ブプレノルフィン)でマウスを麻酔します。鉗子で後肢をつまんで、麻酔の正しい深さを確認します.
手記：本研究では、8-12週齢の雄C57BL/6Nマウスを用いた(体重20-25g)。著者らは、同年齢の雄のBALB/cを試験して失敗したが、他の株は試していない。
- 電気カミソリを使用して、関心のある領域(頭、首)の髪を取り除きます。創傷の汚染を防ぐために、抜け毛が残っていないことを確認してください。その後、70%エタノール/クロルヘキシジン/ベタジンで術野を消毒し、頭を外科医に向けてマウスを仰臥位に置きます。
- 解剖ハサミで頸部正中線を切開します。
- 顎下腺と頸部筋組織を解剖し、それらを分離して総頸動脈を露出させます。主に鉗子による鈍い解剖を使用します。
- 3位 8-0右総頸動脈の下の絹の結紮糸。
- 近位結紮糸にクランプを取り付け、動脈に張力をかけて流れが停止するようにします。
- 最も遠位の合字を閉じます。
- 切開部の頭蓋面にある小さな事前に形成された皮膚穴から動脈カテーテルを挿入します。カテーテルの内腔が大きすぎて血液の逆流を減らすことができないと思われる場合は、カテーテルの内腔を絞って変形させます。3つの合字すべてで固定します。
- 脱臼を避けるために、カテーテルを皮膚に固定します。これを行うには、事前に形成された皮膚穴の領域でカテーテルを皮膚に接続する縫合糸(例:5-0モノフィラメント、非吸収性)を使用します。
2. 気管切開術
- 鉗子を使用して気管前の筋肉組織を鈍く解剖します。
- 2位 8-0気管の下の絹の結紮糸。
- マイクロハサミを使用して、片側換気を避けるために、できるだけ近位に気管切開します。2つの気管軟骨の間に水平の切断線を使用します。
- 換気チューブを挿入し、準備した両方の結紮糸で固定します.
手記：気管の近位端は結紮する必要はありません。
- ランニング縫合糸(例:6-0モノフィラメント、非吸収性)で皮膚を閉じます。
- マウスを150 /分の周波数と200 μLの潮汐量で換気します。
>3. 脳死(BD)誘発
- マウスを腹臥位に配置します。
- 外科用ハサミと鉗子を使用して頭蓋骨から皮膚を取り出し、皮膚を保持します。
- 左頭頂皮質の上に1mm口径のボアホールをパラメディアに開けます。内側のコンパクトな骨と硬膜を破る前に、穴あけを止めてください。
- 鈍い鉗子を使用して頭蓋骨の最終的な組織橋を貫通し、鋭いエッジを取り除きます。
- バルーンカテーテルを挿入して、完全に頭蓋腔内に収まるようにします。バルーンに生理食塩水があらかじめ充填されており、すべての空気が排出されていることを確認してください。
- シリンジポンプを使用して、10-15 分 (総容量 0.8-1.2 mL) にわたって ~0.1 mL/min で膨張を開始します。
手記：マウスは、ミオクローヌス、散瞳、さらなる発作活動、および苦痛のあえぎを示します。
- マウスの尻尾が硬くなって勃起したら、マウスの脳が死んだと宣言します。
手記：BDは、特徴的な初期血圧ピーク(クッシング反射)、脳幹反射の欠如、および自発呼吸によって確認されます。実験中は定期的な無呼吸検査を避ける必要があります。マウスは酸素不足により循環器系が不安定になる可能性があるためです。
- バルーンカテーテルの膨張を止めます。
- 低体温症を避けるために、マウスに加熱ブランケットをかぶせます。