ゼブラフィッシュ幼生における薬物誘発性出血のモデリング

要約

出典:Crilly, S., et al. ゼブラフィッシュの幼生を使用して出血性脳卒中の病理学的影響を研究する。 J. Vis. Exp. (2019)

この動画では、受精したゼブラフィッシュの胚を実体顕微鏡で解体した後、コレステロール合成阻害剤を照射することで、幼虫の血管破裂や脳出血を発症させています。明確な赤い斑点で識別できる出血性の幼虫は、その後、さらなる分析のために顕微鏡下で分離されます。

プロトコル

>注:この研究で使用されたトランスジェニック系統には、マクロファージ特異的系統mpeg1:mCherry(社内で構築)、好中球特異的mpo:GFP、赤血球特異的gata1:dsRed、およびubiq:secAnnexinV-mVenus、野生型、真珠層(mitfa^w2/w2)、および変異体(bbh^m292)の背景での細胞死(社内で再誘導)のレポーターが含まれます。

1. 0日目:卵の生産と収集

1. 1匹のオスと1〜2匹の成体ゼブラフィッシュから生産された繁殖箱で自然産卵からの受精胚を収集します.
   手記：アトルバスタチンプロトコルでは、任意の野生型/トランスジェニック動物を使用することができます。ただし、出血率は株によってわずかに異なります。
2. 標準的なガイドラインに従って、ペトリ皿およびステージごとに、標準的なE3胚培地で100個の胚を28°Cでインキュベートします。
3. 受精後~6時間後(hpf)に、パスツールピペットを使用して、死んだ胚と未受精の胚を皿から取り出します。図1は、実験のタイムラインを示しています。

2. 1日目:アトルバスタチンを24 hpfで治療

1. 鋭利で超薄い解剖鉗子を使用したアトルバスタチン治療のためのデコリオネート胚。実験に必要な数値は、それに応じて調整できます。
2. 30 mLのE3胚培地を2つのきれいなシャーレに加えます。1つの皿で100個の胚を使用します.
   手記：プレートが細胞培養用に設計されている場合、この初期段階ではデコレーションゼブラフィッシュはしばしば底にくっつきます。これを避けるために、使用する前にプレートをきれいな水で十分にすすいでください。
3. 治療プレートから60μLの胚水を取り除き、60μLの0.5mMアトルバスタチン(ATV)を追加します。0.5 mM のストック濃度では、上記の希釈により最終濃度は 1 μM になり、非出血幼虫の ~20% (ICH-)、出血した幼虫の ~80% (ICH+) が得られます。未処理のコントロールにはもう一方のプレートを使用してください.
   手記： アトルバスタチンを蒸留水(3 mgを10 mL)に可溶化して、0.5 mMのストック溶液を作ります。可溶化には時間がかかるため、撹拌しながら室温で暗所で一晩インキュベートします。完全な可溶化には最大1週間かかる場合があります。DMSO(ジメチルスルホキシド)は使用しないでください。溶液を分注し、-20°Cで保存します。凍結融解しないでください。
4. パスツールピペットを使用して、100個の胚をできるだけ少ない水で処理プレートに移します。
5. プレートを28°C.
   でインキュベートします。 手記： ICH(脳内出血)は33〜48hpfで発生します。アトルバスタチンは、24時間を超えるインキュベーションがそれ以上の発達上の問題を引き起こさないため、除去する必要はありません。.

3. 2日目:50 hpfでのICH+集団の分離

1. ICH+魚をICH-個体群から分離し、新しい料理に簡単に移します。
   1. ATVモデルを1μMの濃度で使用すると、この時点で幼虫の75〜100%が出血(ICH+)を示します
      手記：幼虫の反応は株によって異なりますが、幼虫が目的の頻度で出血していない場合は、新鮮なアトルバスタチンのバッチまたは高濃度を使用してください。幼虫が48 hpfまでに出血を示さなかった場合は、それらをICH-と考えてください。
   2. bbhモデルを使用する場合、すべてのホモ接合変異体は48 hpfで出血を示します。ヘテロ接合体を交配する場合、ICH-ヘテロ接合体と野生型兄弟を実験の対照動物として使用することができます。
2. 必要に応じて、E3培地に0.02%MS222を追加して幼虫に麻酔をかけます。パスツールピペットを使用して、幼虫の頭部内の血液の存在を新鮮なE3培地に選別します。図2.
   を参照してください 手記：頭部の血液は、前脳、中脳、後脳、または組み合わせて現れることがあり、出血量は動物によって異なります。bbh変異体では、ICHはしばしば重度の浮腫と関連しており、これは大きな頭、目の間の広い空間、およびよりびまん性の出血によって認識できます。ただし、すべてのICH+ bbh幼虫が浮腫を示すわけではありません。

結果

図 1:脳損傷、自発運動、神経炎症の転帰を特徴付けるための実験タイムラインのグラフィック。ICH、脳内出血;BBH、バブルヘッド。

図 2:ICH+脳出血の表現型。トランスジェニックgata1:DsRedレポーター真珠層の背景を明視野実体顕微鏡(上面)と蛍光(下面パネル)で観察した受精後~48時間で維持された幼虫のICH表現型の例。ICH幼虫には出血は認められませんでした(左パネル)。前脳と後脳(矢印)に赤血球の明確な蓄積がICH+幼虫(右パネル)で観察されました。スケールバーは250μmを表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	シグマ・アルドリッチ	CLS3527
28°Cインキュベーター	LMSの	210
アトルバスタチン	シグマ・アルドリッチ	PZ0001-5mg
ブリーディングボックス	Thoren Aquaticsシステム	10011
ダニオビジョン観測室	ノルダス	該当なし
E3 ミディアム 1x			4% インスタントオーシャン、500 μL メチレンブルー、1 L dH2O
EthoVision XTソフトウェア	ノルダス	バージョン 11
インスタントオーシャン	インスタントオーシャン	SS15-10
顕微鏡	ライカ	MZ95	解剖顕微鏡
P1000ピペット	ギルソン	F144059M
P1000ピペットチップ	スターラブ	S1122-1830
パスツールピペット	スターラブ	E1414-0300
ペトリ皿	コーニング	101VR20
ピペットボーイ	インテグラ・バイオサイエンス	ピペットボーイ
超微細解剖鉗子	寒天科学	AGT502
Zenソフトウェア	ツァイス	バージョン 2.3

名 の