神経前駆細胞およびニューロンにおけるシアロ糖タンパク質の免疫蛍光染色

要約

出典:Bai, Q., et al., シアログリカンの代謝標識による初代神経幹細胞および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、初代神経幹細胞や前駆細胞、ニューロンにおける修飾シアロ糖タンパク質のビオチン化と蛍光標識、および蛍光顕微鏡を用いたそれらの可視化を実演しています。

プロトコル

1. 拡大した一次神経細胞および分化ニューロンにおけるシアロ糖タンパク質の免疫蛍光染色

1. 1.5 mM CuSO₄および9 mM BTTAAを二重蒸留水に含むBTTAA-CuSO₄ complex 1 30xストックを調製します。PBS中に50 μMのビオチン-アルキン、2.5 mMのアスコルビン酸ナトリウム、および1x BTTAA-CuSO₄複合体を含む新しいビオチン結合バッファー1を調製します。
2. 共培養プレートからインサートを取り外します。培養液を底ウェルから吸引し、予め温めたPBSで神経細胞を一度洗浄します。
3. 井戸からPBSを吸引します。ウェルあたり1 mLの予め冷却した4%パラホルムアルデヒドPBS溶液を細胞に加え、室温で10分間固定します。次に、事前に冷却したPBSで細胞を3回洗浄します。
4. ウェルからPBSを吸引し、ウェルごとに調製したばかりのビオチン標識バッファー1 mLを細胞に加えます。細胞を室温で10分間インキュベートします。
5. ウェルから反応バッファーを吸引します。細胞をPBSで3回洗浄します。1% FBSと1 μg/mLのAlexa Fluor 647-ストレプトアビジンを含む染色バッファーを調製します。ウェルあたり1 mLの染色バッファーを細胞に添加し、室温で細胞を30分間インキュベー
トします。
6. ウェルから染色バッファーを吸引し、事前に冷却したPBSで細胞を3回洗浄します。PBS中に5%BSAおよび0.3%非イオン性界面活性剤-100を含むブロッキングバッファーを調製します。1ウェルあたり1 mLのブロッキングバッファーを細胞に加え、室温で10分間インキュベー
トします。
7. 一次抗体溶液を調製するには、抗ネスチン抗体と抗β-tubulin III抗体をそれぞれ1:20および1:1,000の比率でブロッキングバッファーに希釈します。ブロッキングバッファーをウェルから取り出し、ウェルあたり1 mLの一次抗体溶液を細胞に加えます。細胞を4°Cで一晩インキュベートします。
8. ウェルから一次抗体溶液を取り出します。予め冷やしたPBSで細胞を3回洗浄します。Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG1、Alexa Fluor 546ヤギ抗マウスIgG2b、およびDAPIを一緒に1:1,000の希釈でブロッキングバッファーに希釈して、二次抗体溶液を調製します。ウェルからPBSを吸引し、ウェルごとに1 mLの二次抗体溶液を細胞に加えます。細胞をRTで2時間インキュベートします。
9. ウェルから抗体溶液を吸引し、事前に冷却したPBSで細胞を3回洗浄します。その後、セルは画像キャプチャの準備が整います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清	ギブコ	10099141	10%
パラホルムアルデヒド	シグマ	158127	4%
ダピ	ギブコ	62248
6ウェルプレート	コーニング	3335
マウスモノクローナル抗ネスチン	Developmental Study ハイブリドーマバンク	ラット-401	1 から 20
マウスモノクローナル抗β-tubulin III	シグマ	T8860	1 から 1000
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG1	インビトゲン	A-21121	1 から 1000
Alexa Fluor 546 ヤギ抗マウス IgG2b	インビトゲン	A-21143	1 から 1000
トリトンX-100	アムレスコ	694
硫酸銅	シグマ	209198
アルキン-ビオチン	[ケミストリーツール]	TA105
BTTAAの	[ケミストリーツール]	1236
アスコルビン酸ナトリウム	シグマ	A4034の
Alexa Flour 647-コンジュゲートストレプトアビジン	インビトゲン	S21374	1 から 1000

名 名 名