神経成長円錐崩壊に対する凝集アミロイドβのin vitro評価

要約

出典:久保山 隆 Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、アミロイドβ(Aβ)凝集体によるニューロン成長円錐の崩壊のin vitro評価を示しています。ニューロンをAβ凝集体で処理すると、細胞骨格が不安定化し、軸索の先端にある成長円錐が崩壊します。処理した細胞を対照細胞と比較し、成長円錐の崩壊の程度を評価します。

プロトコル

1. コラプスアッセイ

1. ポリ-D-リジンcオーティング
   1. 8ウェル培養スライドに400 μLの5 μg/mLポリ-D-リジン(PDL)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でコーティングし、37°Cで一晩インキュベートします。
   2. PDL溶液を取り出し、蒸留水でウェルを3回洗浄します。
2. ニューロン培養
   1. 12%のウマ血清、0.6%グルコース、および2 mM L-グルタミン(培地A)を含むニューロン培養培地中のマイクロハサミを用いた胚14日目(E14)ddY(Deutschland、Denken、およびYoken)マウスから新たに分離された大脳皮質をミンチします。抗生物質を追加しないでください.
      手記：このプロトコルでは、ddY マウスが使用されます。日本で一般的に使用されているアウトブレッド種です。このニューロン培養プロトコルは、ラット皮質ニューロンにも適用できます。
   2. 組織を87 x gで3分間遠心分離します。
   3. 上清を取り除きます。次に、ペレットに0.05%トリプシン2 mLを加え、37°Cで15分間インキュベートします。
   4. 培地Aを4mL加え、軽くたたいて混ぜます。
   5. 組織を178 x gで3分間遠心分離します。
   6. 上清を取り除き、600 U/mL デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I) と 0.3 mg/mL 大豆トリプシン阻害剤を PBS に溶解して組織をインキュベートし、37 °C で 15 分間、5 分ごとに軽くたたいて混合します。
   7. インキュベーション後、培地Aを4mL加え、タッピングして混合します。
   8. 組織を178 x gで3分間遠心分離します。
   9. 上清を取り除いた後、4 mLの培地Aを加え、磨いたパスツールピペットで組織を粉砕します。
   10. トリチュレートした組織を70μmの細孔サイズのメッシュでろ過します。濾過後、血球計算盤で細胞の密度を計算します。
   11. 8ウェル培養スライドで細胞を培地Aと0.8 x 10⁴細胞/ウェルで培養し、37°Cで10%_CO2の加湿雰囲気の_CO2インキュベーターで維持します。
   12. 培養の4時間後、培養培地をニューロン培養用の2%サプリメント、0.6%グルコース、および2 mM L-グルタミン(培地B)を含むものと交換します
       手記：ニューロンの純度は、前述のように約75%であった。
3. コラプスアッセイ
   1. 市販の完全長アミロイドβ1-42(Aβ1-42)を0.5 mMの濃度の蒸留水に溶解し、37°Cで7日間インキュベートします。インキュベーション後、凝集したAβ1-42溶液を-30°Cの冷凍庫で使用まで保存してください
      手記：このインキュベーションは、Aβの凝集と毒性に必要です。
   2. 4日間の神経細胞培養後、0.5 μMの凝集Aβ1-42またはビヒクル溶液(蒸留水)を含む100 μLの新しい培地Bでウェルを1時間処理します< br /> 手記： Aβ1-42の効果は、前述のように用量依存的に0.1から5μMに増加し、0.5μMでピークに達しました。神経細胞培養の3日後、Aβ1-42を1時間後に処理した場合も同様の結果が観察されます。
   3. 培地を取り出し、直ちにニューロンをPBS中の4%スクロースを含む4%パラホルムアルデヒドでホットプレート上に37°Cで1時間固定します。
   4. 固定後、ニューロンをPBSで3回洗浄し、水性封入剤でマウントします。封入剤を4°Cで2〜4日間乾燥させます。
   5. 倒立顕微鏡で各ウェルの全領域(7.8 x 9 mm²)を20倍乾式対物レンズで撮影します。
   6. 前述したように、ステージ3または4の各ニューロンの最も長い神経突起を軸索として分類します。
   7. 次の基準に従って成長円錐を分類します:1)ラメリポディアを欠く軸索成長円錐体、または2)前述したように、糸状仮足が3つ未満のものは、崩壊した成長円錐と見なされます。
      手記：健康な成長コーンは0ポイントとして採点されます。崩壊した成長コーンは1ポイントとして採点されます。平均崩壊スコアは、治療ごとに計算されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ddYマウス	SLCの
8ウェル培養スライド	隼	354108
ポリDリジン	和光	〒168-19041
培地、ニューロベース培地	ギブコ	21103-049
ハウスセラム	ギブコ	〒26050-088
グルコース	和光	049-31165
L-グルタミン	和光	074-00522
0.05%トリプシン	ギブコ	〒25300-054
DNase I	ワージントン	DP
大豆トリプシン阻害剤	ギブコ	17075-029
メッシュサイズ70μmのフィルター、セルストレーナー	隼	352350
B-27サプリメント	ギブコ	17504-044
CO2インキュベーター	アステック	SCA-165DS
アミロイドβ1-42	シグマ・アルドリッチ	A9810の
パラホルムアルデヒド	和光	〒162-16065
蔗糖	和光	〒196-00015
水性封入剤、AquaPoly/Mount	ポリサイエンス	18606-20
倒立顕微鏡A	カールツァイス	アクシオオブザーバーZ1	AxioCam MRm、ヒーティングユニットXL S、CO2モジュールS1、TempモジュールS1に接続
対物レンズ プランアポクロマート 20x	カールツァイス	420650から9901

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