サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. イメージング質量分析(IMS)のための組織切片の準備
- 解剖された脳の組織標本の処理
手記：IMSのサンプル調製ステップで組織の元の状態が維持されていることを確認します。汚染や死後の変更を避けてください。次のステップは非常に重要です。
- IMSのヒト皮質標本を、死後8時間以内に-80°Cで除去、処理、保存した脳から採取します。アルツハイマー病(AD)患者と年齢を一致させた対照の後頭皮質から脳標本を採取します。
- 凍結組織切片の調製
- クライオスタットで組織切片を切断します。導電性インジウム-スズ-オキシド(ITO)コーティングされた顕微鏡スライドガラスをクライオスタット内に置きます。
- 剖検脳試料をクライオスタット内で-80°Cから-22°Cに温めます。
- 実験ごとに新しい使い捨てブレードをクライオスタットに取り付けます。常に刃のきれいな部分を使用するようにしてください。
- 凍結した剖検脳を、少量の最適切断温度(OCT)化合物(ステージの中央領域を覆うのに十分、材料の表を参照)とともにステージに置きます。
- 薄肉片の条件をお選びください。IMSの場合、人間の脳切片の厚さは10〜12μmです。IMSおよび免疫組織化学(IHC)の場合は、各組織サンプルから5〜6切片を切り取ります。
- ブレードがティッシュを切断し始めたばかりのときは、ホイールを回して、すべてのティッシュが露出するまでブロックに「向き」合わせます。セクション全体に小さな縞や裂け目がある場合は、温度調整によって自動的に修正されるまで、クライオスタットでもう少し待ちます。数秒数カウントしてから、ティッシュを下にしてアンチロールを開きます。
- すぐに、スライドガラスのITOコーティング面にティッシュスライスを置きます。ITOコーティングされていない側のスライドの下に指を入れて、ティッシュスライスを解凍します。ティッシュがスライドにくっつきます。ティッシュがシワのないようにできるだけ平らであることを確認してください。この手順を室温で実行します。
手記：手袋、マスク、実験用ガウンを着用してください。これは、ヒトのサンプルに生物学的汚染物質が含まれている可能性があるためです。その日のすべての切片が作成されたら、クライオスタット、ブラシ、チャックを実験室用ワイプと200mLの100%エタノールで清掃します。
- ティッシュ切片をすすぐ
- サンプルを40〜100 mLの70%エタノールに30秒間浸漬し、内因性脂質と無機塩を除去します。ガラス染色瓶を使用してください。
- 40〜100 mLの100%エタノールで30秒間、40〜100 mLのCarnoy溶液で3分間、40〜100 mLの100%エタノールで30秒間、40〜100 mLの0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で1分間、40〜100 mLの100%エタノールで30秒間サンプルを洗浄します><。
手記：カーノイの溶液は、エタノール6部、酢酸3部、クロロホルム1部からなる固定剤です。
- 真空中で30分間乾燥させます。
- 剖検脳組織からのAβタンパク質のより良いイオン化のためのギ酸蒸気による組織切片の処理
- オーブンとインキュベーションスライドガラスを準備し、5mLの100%ギ酸でその後の気化に使用します。満足のいく酸処理を達成するためには、このステップ全体でインキュベーションガラス皿内の空気湿度を飽和レベルに保ち、温度を60°Cに保ちます。ギ酸に浸らないようにしながら、組織スライドをインキュベーションガラス皿に入れ、6分間処理します。
- フィルムスキャナー、ゲルスキャナー、デジタルマイクロスコープなどを用いて試料の光学像を撮影し、室温で行ってください。サンプルの光学像のアライメントは、サンプルターゲットを装置内に配置する際に必要です。通常、マトリックス層の下の組織切片を認識することはできません.
注意: 光学画像を撮影する最も便利な方法は、オフィススキャナーを使用することです。画像データの保存フォルダに画像を保存するとよいでしょう。
- 光学画像とサンプルを相関させるには、光学画像とカメラ光学部品のマトリックス層の下の両方に見えるガイドマークを作成します。最も簡単な方法は、光学画像を撮影する前に、サンプルの周囲に少なくとも3つの補正液マークを見つけることです。
- マトリックスアプリケーション
- マトリックス溶液の調製
- 有機溶媒耐性マイクロチューブに、50%アセトニトリル(ACN)と0.1%TFAを含む10 mg/mLシナピン酸(SA)溶液を調製します。SA化合物をボルテックスまたは短時間超音波処理して10分間完全に溶解します。溶液は使用するまで室温で保存します.
注:マトリックススプレーには、エアブラシ、超音波噴霧器、または自動噴霧器の3つの異なるオプションがあります。
- エアブラシでマトリックスをスプレーする
- 一定の室温(20〜23°C)と湿度(40%〜60%)で操作してください。最適なスプレーのために調整するパラメータには、液滴のサイズ、ミストの量、スプレーノズルと組織切片の間の角度と距離、実験室の温度と湿度が含まれます。顕微鏡の結果を確認してこれらの条件を調整します.
手記：制限要因には、マトリックスカバレッジの結晶サイズと均一性、および分析種の望ましくない移動/拡散が含まれるため、液滴サイズには小さいほど適しています。均質性も検査のポイントです。
- 超音波噴霧器によるマトリックスの噴霧
- 噴霧するティッシュをデシケーターから取り出し、チャンバーに入れます。ティッシュがセンサーウィンドウを覆っていないことを確認してください。
- スタートボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約90分です。調製は、マトリックス層の厚さと湿り具合のモニタリングを通じて自動的に調整されます。準備が完了したら、スライドを取り外し、デシケーターに15分間保存してから、MALDI装置で読み取ります。
- スプレーヘッドがきれいに見えるまで、2〜3mLの100%メタノール(MeOH)で噴霧器を清掃します.
手記：マトリックス液滴の微細な霧が重力シートによって組織に沈むのを許されます。平均20μmの液滴サイズが生成されます。すべての液滴径は50μm未満です。
- 自動噴霧器によるマトリックスの噴霧
- マトリックス溶液を自動噴霧器で組織表面にスプレーします。加熱されたシースガス(N2、10 psiおよび75 °Cに設定)の一定の流れが、マトリックス溶液スプレーと同時に供給されます。溶媒ポンプシステム(10 psiおよび0.15 mL/minに設定)を使用して、マトリックス溶液を送液します
手記：最も重要なことは、マトリックスエアロゾルの吸入を避けるために、安全キャビネットの下で作業することです。室温と湿度を制御して、均一なマトリックス結晶化を再現します。
2. MALDI-IMSです。
- 超高速質量分析を行います。
- 10 kHzネオジムドープイットリウムアルミニウムガーネット(Nd:YAG、355 nm)レーザーを搭載したMALDI-IMSを使用して、ハイスループットで高空間分解能のイメージング実験を行います。
- 質量分析測定では、MALDI制御ソフトウェアとデータ解析ソフトウェアを使用して組織領域を定義します。
- m/z 2,000〜20,000の質量範囲と20〜100μmの空間分解能を持つ正の線形モードでスペクトルを取得します。
- キャリブレーションスタンダードを作製するには、ペプチドキャリブレーションスタンダードとタンパク質キャリブレーションスタンダードをα-シアノ-4-ヒドロキシル-桂皮酸(CHCA)と1:4の比率でTA30溶液(ACN:0.1% TFA = 30:70)に溶解し、10倍に希釈します。スライド上のキャリブレーションスタンダード1 μLをスライドの4つの異なる場所に置きます。
- 分子組織学ソフトウェア(Table of Materialsを参照)を使用して、複数の単一画像を重ね合わせ、老人斑(SP)や動脈壁に共局在する異なるAβペプチドなど、さまざまなシグナルの空間的相関を見つけます。
