ラットモデルにおける脳微小出血の検出

要約

出典:Li, D., Zhào, H., et al. ラットにおけるリポ多糖注射による亜急性脳微小出血 。(2018年)。

このビデオでは、ラットモデルで脳微小出血(CMH)を検出するアッセイを実演しています。CMHは、血液脳関門の破壊による脳出血であり、漏出した赤血球(RBC)によって特定されます。ラットモデルでは、固定された脳組織を凍結保護し、切片化し、赤血球のヘマトキシリン-エオシンで染色することで、CMHの顕微鏡観察を可能にします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 材料

1. リポ多糖(LPS)注射剤の調製
   1. 25 mLの蒸留水をサルモネラ菌由来のLPS粉末25 mgに加えて、最終濃度を1 mg / mLにします。.注射液は滅菌チューブに入れて4°C.
      で保存してください。 注意：LPSは有毒です。
   2. 通常の0.9%生理食塩水に2%エバンスブルー(EB)溶液を調製して、EB注入を作業濃度に保ちます。.

2. 動物

10週齢の雄Sprague-Dawley(SD)ラット(平均体重280±20g)に腹腔内注射によりLPSを投与する
注意：ラットが他の組織から購入された場合、適応期は7日以上でなければなりません。

3. LPSインジェクション

1. LPSを各ラットに1 mg / kgの用量で腹腔内に注射し、ラットを自宅のケージに戻します。
   手記： 麻酔は必要ありません。
2. 6時間後、同じ用量のLPS注射をラットに注射します。
3. 16時間後、ラットに同用量のLPSを注射します
   注意： SDラットにLPSを1 mg / kgの用量で注射すると、死亡率が5%になる可能性があります。.死亡率は、若年または高齢のラットまたは妊娠中の雌ラットでさらに増加する可能性があります。
4. LPS注射後、ラットをケージに戻し、食べ物や飲み物を自由に利用できるようにします
   手記： ラットは明確な全身性炎症反応を示すため、実験中、ケージが清潔なままであることが不可欠です。ラットは、最初のLPS注射後、体重、一般的な外観、態度を頻繁に(2日)監視する必要があります。.ラットが猫背の姿勢、動きたくない、大幅な体重減少 (>20%)、ポルフィリン染色を示し始めた場合、7 日間の EB 研究終了点の前に人道的に安楽死させられます。

4. サンプルコレクション

1. EBインジェクション
   1. 最初の注射から7日後、承認されたIACUCプロトコルに従ってラットを腹腔内に麻酔します。
   2. ラットが角膜反射反応を示さなくなるまで1〜2分待ちます。.各ラットに5〜8mmの深さの心臓穿刺を行います。穿刺点は、第3および第4肋間腔の胸骨の左縁から5mmである必要があります。
   3. 血液の回復が観察されるまで待ってから、EBを0.2 mL / 100 g体重の用量で左心室に注入します><。 注意：心臓穿刺とEB注射は慎重に行う必要があります。EBは、左心室ではなく胸腔または心膜に注入される場合があります。
      1. 空のチューブで吸引し、注入前にこのボリュームをEBチューブと交換して、失敗率を減らします(例:エラーによる胸郭への注入)。
   4. ラットを仰臥位に10分間保持します.
      注:免疫蛍光イメージングでEB漏れを検出するためにサンプルを使用しない場合、この手順は省略できます。
2. 肉眼的観測
   1. 氷冷した1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して心臓灌流を行い、脳血管系と脳をクリアにします。
      1. メスを使用して、横隔膜の全長にわたって腹部を切開します。
      2. 胸郭の正中線のすぐ左にあるリブを切り取ります。
      3. 胸腔を開きます。クランプを使用して心臓を露出させ、血液やその他の体液の排出を促進します。
      4. 鉗子で心臓をしっかりと保持しながら(心臓はまだ鼓動しているはずです)、左心室の突起に直接針を挿入してこれを約5mmに伸ばします。針を入口付近でクランプしてその位置に固定します。
         注意：針を過度に伸ばすと、内壁を貫通して溶液の循環が損なわれる可能性があります。
      5. バルブを放し、灌流ポンプを使用して、氷冷PBS溶液(200〜300 mL)を約20 mL/minのゆっくりと安定した速度で流します。動物が肉眼観察の代わりに固定を必要とする場合は、同じ用量の氷冷0.9%生理食塩水を使用してください。
      6. 鋭利なハサミを使用して、アトリウムに切開を行い、溶液が連続的に流れるようにします。液体が自由に流れない場合、または動物の鼻孔や口から出ている場合は、針の位置を変えます。
   2. 全眼観測によるCMHのスクリーニング.
      手記：サンプルがグロスオブザベーションによるCMH数の計算に使用されない場合、この手順は省略できます。
3. 固定
   1. 氷冷した0.9%生理食塩水(200〜300 mL)を使用して心臓灌流を行い、脳血管系と脳をきれいにします。
   2. 固定のために氷冷した4%パラホルムアルデヒドを使用して心臓灌流を行います。
   3. ラットの首を切り、脳を分離し、脳を20%ショ糖溶液に少なくとも6時間浸します。
   4. 溶液を30%スクロースに交換し、さらに6時間固定します。
4. クライオスタットを使用して、厚さ10mmの脳組織切片を調製します。

>5. ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色

>注:この手順はHE染色キットを使用して実行されます。

1. スライドを蒸留水で洗います。
2. ヘマトキシリン溶液で8分間染色し、水道水で5分間洗浄します。
3. 1%酸性アルコールで30秒間分化し、水道水で1分間洗浄します。
4. 0.2%アンモニア水(ブルーイング)または飽和炭酸リチウム溶液で30秒から1分間染色し、水道水で5分間洗浄します。
5. 95%アルコール(10ディップ)ですすいでください。
6. エオシン溶液で30秒から1分間対比染色します。
7. 95%アルコール、無水アルコールの2回の交換、各5分間で脱水します。
8. キシレンで30秒間透明にします。
9. Liuの方法を使用してマウントします。
10. 明視野蛍光顕微鏡を使用して分析します.
    手記： CMHの成分である血管から放出された赤血球は、HE染色下で赤橙色に現れます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
組合	シグマ・アルドリッチ	L-2630	炎症誘発用
EBの	シグマアルドリッチ	E2129	EB漏れ検出用
HE染色	ソーラーバイオ	G1120	HE染色用キット
クロラール水和物	シグマ・アルドリッチ	47335ユー	麻酔用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ソーラーバイオ	P1022	実験で一般的に使用される一種の緩衝液
0.9%生理食塩水	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., 中国		灌流のためのソリューション
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	158127	固定に一般的に使用される一種の溶液
20%スクロース溶液	ソーラーバイオ	G2461	固定に一般的に使用される一種の溶液
30%ショ糖溶液	ソーラーバイオ	G2460	固定に一般的に使用される一種の溶液
獣医軟膏	Solcoserylアイジェル、バセル、スイス		ネズミの目の保護のために

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