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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 初代海馬細胞培養
- ラット海馬の解離細胞培養液を胚19日目に調製します。ポリエチレンイミン(PEI)でコーティングされた12 mmカバースリップに細胞を24ウェル皿に50,000〜60,000細胞/ウェルの密度でプレートします。細胞計数チャンバーと位相コントラスト光学系を使用して密度を確認します。
- インキュベーター内の24ウェルプレートで3日間(in vitro(DIV)3日)培養し、37°Cで5%CO2を添加します。
- 透過光顕微鏡(例:10〜20倍の倍率の位相コントラスト光学系)を使用して、細胞の健康状態の指標となるカバースリップを評価します。次の健康状態の指標を確認してください:明確な位相コントラストハロー、ビーズ構造のない神経突起、体細胞のクラスタリングや神経突起の束ねなし。
>2. トランスフェクション
>注:以下のプロトコルは、3ウェルのダブルトランスフェクションを指します。ただし、このプロトコルは、4つのウェルに十分な量が調製されている場合に最も効果的です。
- 500 mLのトランスフェクションバッファー(274 mM塩化ナトリウム、NaCl、10 mM塩化カリウム、KCl、1.4 mMリン酸水素二ナトリウム、Na2HPO4、15 mMグルコース、42 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES)を三角フラスコに調製します。
- NaCl 8.0 g、KCl 0.37 g、Na2HPO4 0.095 g、グルコース 1.35 g、HEPES 5.0 g を 400 mL の蒸留水に Erlenmeyer フラスコで溶解します。
- pHメーターを使用して、1 M水酸化ナトリウム、NaOHでpHを6.95に調整します。
- 蒸留水で容量を500mLに調整し、pHメーターでpHを確認します。
- トランスフェクションバッファーに1 M NaOHをピペットで移し、以下のpH値でトランスフェクションバッファーを20〜30 mL分作製します:6.96、6.97、6.98、6.99、7.00、7.01、7.02、7.03、7.04、7.05、7.06、7.07、7.08、7.09、7.11.
注:トランスフェクションバッファーのpHは、トランスフェクションの有効性にとって非常に重要です。
- トランスフェクションされた細胞の数が最も多いトランスフェクションバッファーをテストするには、6.96から7.11までの各pH値をテストします。2.2 - 2.11に記載されているトランスフェクション法と、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する検証済みプラスミドを使用してください。トランスフェクションバッファーのpH値ごとにカバースリップあたりのトランスフェクション細胞数を決定し、どのバッファーが最適に機能するかを評価します。
- トランスフェクション効率が最も高いバッファーを2 mLの微量遠心チューブに分注し、チューブを凍結して-20°Cで保存します。
- 還元した血清培地、細胞培養培地、および蒸留水をウォーターバスで37°Cに予温します。
- トランスフェクションミックスを1.5 mLの微量遠心チューブで調製します。層流フードの下で作業し、無菌の作業条件を確保します。
- 7.5 μL の 2 M 塩化カルシウムを、各エンドトキシンフリー DNA (Synaptophysin-mOrange および mGFP/GFP-Rogdi) 4 μg と混合します。1.5 mLの微量遠心チューブに水を加えて、総容量が60 μLになるようにします。
- 60 μLのトランスフェクションバッファーを混合物に加えます。最良の結果を得るには、トランスフェクションバッファーを滴下しながら、DNAミックスをボルテックス上で穏やかに振とうします。
- 室温(RT)で20分間インキュベートします。インキュベーション時間中にインキュベーションチューブを振らないように、チューブを層流フードの隣に置きます。
- 層流フードの下で、1000 μLピペットを使用して細胞培養培地(「馴化培地」)をウェルから取り出し、インキュベーター内の別の容器に保管します。
- 500 μLの還元血清培地を各ウェルに加えます。細胞を37°Cおよび5%CO2で、20分間のインキュベーション期間(ステップ2.3.3)が終了するまでインキュベートします。
- 各ウェルに30 μLのトランスフェクションミックスを数滴ピペッティングして加えます。チューブの底にある残留物を捨てます。
- すべてのウェルにトランスフェクションミックスが供給されたら、24ウェルプレートを静かに振とうして、トランスフェクションミックスが培地に分布するようにします。
- ウェルを37°Cおよび5%CO2で60分間インキュベートします。
- トランスフェクションミックスを取り出して廃棄し、細胞培養液で3回洗浄します。各ウェルに1 mLの細胞培養培地を加え、室温で30秒間インキュベートし、750 μLの培地を取り出し、同量の新鮮な培地を加えます。これを 3 回繰り返します。
注:洗浄ステップは重要です。各ウェルに培地がない時間は最小限に抑え(つまり、ウェルごとに取り外して交換します)、洗浄培地を穏やかに加えます。
- 細胞培養培地を取り出して廃棄し、450 μLのコンディショニング培地をウェルごとに加えます。
- ニューロンをインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2〜DIV 10で成熟させます。
3. 刺激とSyt1の取り込み
>注:次のプロトコルでは、取り込みを3つのウェルに適用します。他の数のウェルの分極解除については、それに応じて量を調整します。
- 50 mLの10倍分極解除緩衝液(640 mM NaCl、700 mM KCl、10 mM塩化マグネシウム、MgCl2、20 mM塩化カルシウム、CaCl2、300 mMグルコース、200 mM HEPES、pH 7.4)を三角フラスコで調製します。
注:脱分極バッファーは、数週間4°Cに保持できます。非脱分極性溶液も使用する場合は、1290 mM NaCl、50 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM CaCl2、300 mM Glucose、200 mM HEPES pH 7.4からなる10x Tyrode溶液を調製して、刺激によるリサイクルと自然発生的なリサイクルを比較します。1倍に希釈した後、使用前に1 μMのテトロドトキシンを加えて、活動電位の発生をブロックします。
- NaCl 1.87 g、KCl 2.61 g、MgCl2-6H 2O0.1 g、CaCl 2-2H2O0.15 g、CaCl 2-2H 2 O、3.0 g、グルコース-1 H2O、HEPES2.38 gを50 mLの蒸留水に三角フラスコで溶解します。NaOHでpHを調整し、溶液を滅菌ろ過します。バッファーを蒸留水で1:10に希釈して、1倍の濃度にします。
- 刺激後の固定のために、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.4)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。
- 1x PBS中の4%PFA500 mLについて、パラホルムアルデヒド20 gを蒸留H2O450 mLに溶解します
注:溶液を加熱すると溶解が速くなる場合がありますが、PFAが崩壊する可能性があるため、溶液を70°C以上に加熱しないでください。
注意：PFAは毒性があり、発がん性があり、催奇形性があります。PFAを取り扱うときは手袋を着用し、ドラフト内で作業し、摂取を避けてください。
- 溶液を室温まで冷まし、10x PBSストック溶液50 mLを加えます。NaOH/HCl(塩酸)でpH計でpHを7.4に調整します。
- 600 μLの1倍分極解除バッファーと10 mLの細胞培養培地をウォーターバスで37°Cに予温します。
- 1 μL のマウス抗 Syt1 抗体 (クローン 604.2) を 1x 分極解除バッファーに加え、10 秒間ボルテックスします。
- 細胞培養培地を細胞から取り出して廃棄します。各ウェルに200 μLの脱分極抗体ミックスを加え、インキュベーター内で37 °Cおよび5% CO2で5分間インキュベートします。
- 脱分極抗体ミックスを取り出して廃棄し、細胞培養培地で3回洗浄します。各ウェルに1 mLの細胞培養培地を加え、室温で30秒間インキュベートし、750 μLの培地を取り除き、同量の新鮮な培地を加えます。3回繰り返します。
- 細胞培養培地を取り出して廃棄し、1x PBSに300 μLの4% PFAを加えます。4°Cで20分間インキュベートします。
- 1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。
4. 免疫細胞化学
- ブロッキングバッファー50mLを調製します。
注:ブロッキングバッファーは、-20°Cで数ヶ月間保持できます。
- 2.5 gのスクロースと1 gのウシ血清アルブミン(BSA)を5 mLの10x PBSストック溶液に溶解します。10%洗剤原液1.5mLを加えます。すべての成分が適切に溶解するまで溶液を攪拌し、蒸留H2Oを最終容量50 mLに達するまで加えます。溶液を分注し、分注を凍結して保管します。
- 各ウェルの200 μLのブロッキングバッファーで、各ウェルの200 μLで1:1000の希釈で、二次蛍光蛍光結合抗体(一次Syt1抗体種に対して向けられた抗体)を希釈します。
- カバースリップを含む各ウェルから1x PBSを取り外して廃棄します。
- 200 μLのブロッキングバッファー-抗体ミックスを各ウェルに加え、RTで60分間インキュベートします
注意：二次抗体は光感受性であるため、前進するすべてのステップは暗闇で実行する必要があります。
- インキュベーション後、1x PBS1 mLで細胞を5分間3回洗浄します。
- 埋入媒体を使用して、カバースリップを顕微鏡スライドに埋め込みます。
- 7 μL滴の包埋培地を顕微鏡スライドに加えます。24ウェルプレートのカバースリップをシリンジで持ち上げ、鉗子でつかんで取り外します。
注意：カバーガラスの表面の細胞は傷つきやすいため、鉗子の取り扱いには注意が必要です。
- カバースリップを蒸留水に浸してPBSを取り除き、片方の端を軟組織に触れて慎重に乾燥させます。
- カバースリップを包埋培地の液滴にひっくり返し、細胞を運ぶ表面が顕微鏡スライドに面するようにして、細胞を包埋培地に埋め込みます。
- スライドをボンネットの下で1〜2時間乾燥させ(光への露出を避けるために覆います)、4°C.
の顕微鏡スライドボックスに保管します
注:プロトコルはここで一時停止できます。