α-シヌクレイン凝集体で処理したニューロンの免疫染色

要約

出典:Panattoni, G., et al. Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、α-シヌクレイン(αS)凝集体で処理されたニューロンの免疫染色を示しています。ニューロンは最初にαS凝集体で処理されます。その後、それらを固定し、透過処理し、ブロッキング溶液で処理します。一次抗体を添加し、続いて蛍光標識二次抗体と核染色剤を添加します。次に、サンプルをマウントし、顕微鏡で観察します。

プロトコル

1. ニューロンの治療

>注:治療はディビジョン(DIV)7で行われています。すべてのステップは、無菌状態で細胞培養フードの下で行われます。DIV 7における皮質ニューロン培養密度の例を図1に示します。

1. 3つの異なる疾患トランスジェニックマウスの脊髄から得られたプールミクロソーム関連αS凝集体は、元のホモジナイゼーションバッファー[250 mMスクロース、20 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、10 mM KCl(塩化カリウム)、1.5 mM MgCl₂((塩化マグネシウム)、2 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)からなる)を使用して、1 μg/μL溶液を有する。 および希釈のための1xホスファターゼ/プロテアーゼ阻害剤]。
2. 培地(2% B27、10xゲンタマイシン、および2 mMグルタミン)を含む24ウェルプレートのポリD-リジンカバースリップでニューロン培養を行います。培地の1/3を取り出し、2%B27、1xゲンタマイシン、および2mMグルタミンを含む新しい培地と穏やかに交換します。
3. プールされたミクロソーム関連α-シヌクレイン(αS)凝集体1 μgを細胞培地に加えます。ニューロンを37°Cのインキュベーターに戻します。
4. 1週間、3日ごとに、新鮮な培地の1/3を追加します。メディアを交換しないでください。追加するだけです。
5. 治療の1週間後、培地の1/3を取り出し、2%B27、10μg/mLのゲンタマイシン、および2mMのグルタミンを含む新しい培地と穏やかに交換します。3日ごとに繰り返します。
6. 治療の2週間後にニューロンを固定します(DIV 21)。

2. 免疫蛍光

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1xおよび5%ショ糖溶液中の2%パラホルムアルデヒドで、化学ヒュームフードの下で振とうせずに室温(RT)で15分間ニューロンを固定します。
2. 固定液を取り外してください。PBS 1x、3回で短時間洗います.
   手記：一次ニューロンはポリリジンカバースリップにしっかりと付着しないため、すべての洗浄手順を穏やかに行ってください。
3. 0.3%の非イオン性界面活性剤をPBS 1x中のRTで5分間ニューロンを透過化します。
4. PBSで1回、3回簡単に洗います。
ニューロン
5. を3%ウシ胎児血清(FBS)とPBS 1xでRTで30分間インキュベートし、眼窩シェーカー上の非特異的結合部位をブロックします。
6. オービタルシェーカーで、PBS 1x, O/Nの3% FBSに溶解した適切な一次抗体とニューロンをインキュベートします。
   注:syn303(1:1,000)、マウスαS(1:200)、pser129-αS(1:1,000)、およびTau(1:10,000)抗体を使用しました。
7. 抗体溶液を取り出し、PBS 1xで短時間3回洗浄します。
8. NPS中の3% FBSに溶解した適切な蛍光二次抗体とニューロンを、オービタルシェーカー上の暗闇のRTで1時間インキュベートします。
9. 抗体溶液を取り出し、PBS 1xで短時間3回洗浄します。
10. DARPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液(PBS 1x中0.1 μg/mL)で、オービタルシェーカーの暗闇で15分間、ニューロンを
染色します。
11. 抗体溶液を取り出し、PBS 1xで短時間3回洗浄します。
12. カバースリップを色あせ防止封入剤を使用してスライドに取り付けます。

結果

図 1.皮質ニューロン培養。皮質ニューロン培養のDIV 7における密度を示す代表的な画像。画像は倒立型光学顕微鏡、10倍対物レンズで撮影されました。スケールバー = 100 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	84097から1キロ
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	H0887-100ミリリットル	1M pH=7-7.6
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	0390-100ミリリットル	pH=8 0.5M
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M8266-100G
炭酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S7795-500G
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761-500G
メタノール	シグマ・アルドリッチ	322415から6X1L
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9541-500G
cOmpleteミニ	ロシュ	11836170001	プロテアーゼ阻害剤
フォスストップ	ロシュ	4906837001	ホスファターゼ阻害剤
BCAタンパク質アッセイキット	ユーロクローン	EMPO14500
Criterion TGX 4-20% ステインフリー、18ウェル	バイオラッド	5678094
サポートニトロセルロースメンブレン	バイオラッド	1620097	0.2μm
ブロッティンググレードブロッカー	バイオラッド	1706404	無脂肪粉乳
SuperSignal West Pico 化学発光基質	テルモフィッシャーサイエンティフィック	34077
硝酸	シグマ・アルドリッチ	1004411000	65パーセント
ガラスカバースリップ	テルモフィッシャーサイエンティフィック	1014355118NR1	18mm×
ポリ-D-リジン	シグマ・アルドリッチ	P7280
ハンクのバランスの取れた塩溶液	テルモフィッシャーサイエンティフィック	14170-500ミリリットル
ペニシリン/ストレプトマイシン	テルモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	10,000 U/mL、100 mL
ダルベッコのモディファイドイーグルのミディアム	テルモフィッシャーサイエンティフィック	D5796-500ミリリットル
トリプシン-EDTA	テルモフィッシャーサイエンティフィック	15400054	0.50パーセント
B27	テルモフィッシャーサイエンティフィック	17504044	50倍
グルタマックス	テルモフィッシャーサイエンティフィック	〒35050-038	100倍
DNAse	シグマ・アルドリッチ	D5025
ウシ胎児血清	ユーロクローン	EC50182L
グルタミン酸	シグマ・アルドリッチ	1446600から1G
ゲンタマイシン	テルモフィッシャーサイエンティフィック	15710	10 mg / ml
ニューロベースルミディアム	テルモフィッシャーサイエンティフィック	〒10888-022
シトシンアラビノシド(AraC)	シグマ・アルドリッチ	C3350000
VECTASHIELD退色防止封入剤	ベクターラボラトリーズ	H-1000
ダピ	テルモフィッシャーサイエンティフィック	62247
90 Tiローター	ベックマン	該当なし	超遠心ローター
オプティマL-90K超遠心分離機	ベックマン	該当なし
Syn-1抗体、クローン42	BDバイオサイエンス	610786	アンチマウスWB:1:5000
Syn303	バイオレジェンド	824301	マウス防止IF:1:1000
タウ抗体	シナプス系	314002	ウサギ耐性IF:1:10,000
pser129-αS 抗体	藤原らからの贈り物、参考文献19		アンチウサギWB:1:5000
pser129-αS 抗体	アブカム	AB51253	アンチウサギIF:1:1000
マウスαS(D37A6)XP	細胞シグナル伝達	4179	アンチウサギIF 1:200
Alexa Fluor 555標識抗ウサギ抗体	テルモフィッシャーサイエンティフィック	A27039 (英語
Alexa Fluor 488標識抗マウス抗体	テルモフィッシャーサイエンティフィック	A-11029
マイクロソン XL-2000	ミソニックス		ソニケーター
ウルトラボトル(オークリッジボトル)、PCB、16x76mm、アセンブリ、ノリルキャップ、ベックマンタイプ	サイエンスサービスEU	S4484	超遠心チューブ
AXIO Observer 倒立型光学顕微鏡	ツァイス	該当なし
TCS SP2 レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカ	該当なし
倒立型落射蛍光顕微鏡	ニコン	該当なし
トリトン x-100	シグマ・アルドリッチ	100〜500ML	非イオン性界面活性剤

型 サプリメント の 抗体 名 )