ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける伸張損傷のin vitroモデル

要約

出典:Phillips, J. K. et al.96ウェルフォーマットのヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロンの高速伸張損傷のための方法。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、ヒトが誘導した多能性幹細胞由来ニューロン(hiPSCN)に伸張損傷を誘発するプロセスを示しています。細胞は、シリコンメンブレンが付着した底なしのマルチウェルプレートで採取されます。制御された機械的ストレスが膜に加えられ、細胞骨格の破壊と細胞膜の損傷を誘発し、細胞に伸張損傷の表現型を誘導します。

プロトコル

1. プレート製作

1. 96ウェルプレートの上部を200 Wプラズマクリーナー(材料表を参照)で高出力で60秒間プラズマ処理し、プラズマクリーナーの内側に下面を上にして配置します。チャンバーの窓から見える紫色の光は、有効なプラズマが形成されたことを示しています。このボンディング技術は、Sunkara et al.
2. 60秒以内に、プレート上部を脱イオン(DI)水中の1.5%(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)200 mLに下向きに20分間置きます。この溶液は不安定です:プレートを導入する前に60秒以内に準備してください.
   注意： ヒュームフードでAPTESと連携できます。
3. プラズマは、抽出されたシリコーン膜をプラズマクリーナーで60秒間高出力で処理します。ステップ1.2の20分期間が終了する5分以内にプラズマ処理が終了するように、プラズマ処理の時間を計ります。
4. 鉗子を使用して、7.5 x 11 cm²の羊皮紙の長方形の上にプラズマ処理された膜を配置します。7.5 cm x 11 cm x 0.5 cmのアルミニウムスラブをプレート製造クランプの下部に位置合わせします。鉗子を使用して、シリコンメンブレンとパーチメント紙をアルミニウムスラブに位置合わせします。
5. プレートトップをAPTESバスから取り外し、余分な溶液を振り落とします。200 mLのDIウォーターバスに5秒間浸し、余分な水を振り落とします。別の200mLのDIウォーターバスに5秒間浸し、余分な水を振り落とします。別のプレートトップを浸す前に、これらのバスの水を交換してください。
6. 圧縮空気を使用して、プレートトップを完全に乾かします。
7. プレートの上部をプレート製造クランプの上部に置きます。プレート製造クランプを静かに閉じて、プレートの上部とシリコンを一緒に押します。少なくとも1時間クランプします。
8. プレートを室温で24時間硬化させてから使用し、ほこりから保護します。

2. プレートのストレッチ

1. 圧子を清掃します
   1. 室温でDI水を入れた60Wバス式ソニケーターを準備します。
   2. ソニケーターバスの上のインデンターブロックを逆さにして、インデンターの上部のみが少なくとも1mmの深さまで沈めるようにします。
   3. 圧子を圧縮空気でブロードライします。
2. 圧子ブロックを整列させる
   1. ライブフィードのあるカメラをストレッチデバイスの上に配置し、圧子アレイを見下ろすようにします。圧子の上部に焦点を当てます.
      手記：セクション 3「メンブレン ストレッチの特性評価」で説明されているセットアップは、このタスクで可能なカメラ セットアップの 1 つです。
   2. ステージclを使用して傷害装置のステージにプレートを固定しますamps(図1)および装置の上にドームライトを置きます.
      手記： 機器制御ソフトウェアの材料表を参照してください。
   3. 傷害装置を制御しているコンピューターのデスクトップにあるソフトウェアアイコンをクリックして、機器制御ソフトウェアを起動します。「in_vitro_neurotrauma.lvproj」プロジェクトをクリックして、起動ウィンドウで実行します。プロジェクトウィンドウから、モーションコントロールとポジショントラッカーのバーチャルインストゥルメント(VI)(それぞれ「motion_control.vi」と「position_tracker.vi」という名前)をダブルクリックして起動します。
   4. 傷害装置を囲むケージを閉じます。モーションコントロールVIの左上隅にある「矢印」ボタンを押してVIを実行し、「ニアボトム」をクリックしてステージを圧子に接触させて2mm以内に下げます。「停止」ボタンをクリックして、VI.
      を停止します 注意：ケージ内のカメラを操作するときは、ストレッチャーに手を近づけないでください。ケージには、ケージのドアが閉じているときにのみストレッチデバイスに電力を供給するドアスイッチを取り付ける必要があります。
   5. プロジェクトウィンドウで、「Axis 1」を右クリックします。「Interactive Test Panel」をクリックします。開いたウィンドウで、[Target Position]フィールドに「500」単位を入力して、ステップサイズを50μmに設定します。
   6. 「インタラクティブテストパネル」ウィンドウの下部にある緑色の「実行」ボタンを繰り返しクリックし、プレートが最初に圧子に接触するまで押し続けます。カメラに表示されるライブ画像で接触を確認してください。「インタラクティブテストパネル」ウィンドウの左上に報告された垂直ステージ位置に注意してください。これがファーストコンタクトポジションです。
   7. (ステップ2.2.6で説明したように)さらに下降し、すべてのウェルが圧子と接触するまで下げます。必要に応じて、カメラを動かしてプレート全体を表示し、ステージを上下に動かします(負の「ターゲット位置」を指定します)。すべてのポストが接触しているときのウィンドウの左上に報告される垂直ステージ位置に注意してください(これが完全な接触位置です)。
   8. ファーストコンタクトとフルコンタクトの位置の違いに注意してください。「インタラクティブテストパネル」を閉じます。「モーションコントロールVI」(ステップ2.2.4を参照)を実行し、「上」をクリックしてステージを上げます。「停止」ボタンでモーションコントロールVIを停止します。
   9. ステージが移動の頂点に達したら、ドアを開けてデバイスを無効にします。圧子ブロックの角にある止めネジを合わせます。最初に接触した角の止めネジを緩め、それを下げ、反対側のネジを締めて最後に接触した角を持ち上げます。
   10. プレートが圧子に接触するまでステージを下げ、接触画像の傾きを検査し、ステージを持ち上げ、圧子ブロックを調整します(手順2.2.9)。ステージとブロックが揃うと、すべての圧子が一度に接触します。
   11. ドアを開けて、デバイスを無効にします。タイダウンネジを圧子ブロックの穴に挿入して締めます。ブロックが固定ネジを所定の位置に固定して水平になっていることを確認します(手順2.2.4-2.2.8)。プレートが接触したときに「インタラクティブテストパネル」によって報告されるステージ位置に注意してください。これは、インデンテーション実験のゼロ位置になります。
3. 圧子を滑らかにします
   1. 圧子ブロックがセットアップされたばかりで、まだ潤滑されていない場合は、エタノールを染み込ませたラボワイプで、固体ゴムパッド(7.5 cm x 11 cm x 1.5 mm)と軟質独立気泡発泡ゴムパッド(7.5 cm x 11 cm x 3 mm)を清掃します。風乾させます。
   2. ラボワイプをコーン油に浸し、固いゴムパッドに広げてくすんだ輝きにします。
   3. フォームパッドを固体ゴムパッドに置き、オイルをフォームパッドに移します。発泡スチロールパッドの上に7.5cm×11cm×0.5cmのアルミスラブを敷き詰め、バラスト重量約360g(例:コニカルチューブ6本にそれぞれ45mLの水を入れたもの)を装填し、固体ゴムパッドから発泡スチロールパッドへの油の移動を一定に保ちます。オイルが発泡ゴムパッドに移るまで10秒待ちます。
   4. 発泡ゴムパッドを圧子アレイに移動します。アルミニウムスラブとその上にバラストウェイトを置き、圧子の先端にオイルが一貫して移動するようにします。オイルが圧子に移るまで10秒待ちます。
   5. 圧子ブロックを初めてセットアップして潤滑してからプレートが伸びていない場合は、実験を開始する前にテストプレートを伸ばしてください。注: これにより、最初のストレッチと後続のストレッチの間の不一致によって実験が混乱するのを防ぐことができます。後続のストレッチでは、各ストレッチの前に手順 2.3.2 から 2.3.5 のみを繰り返します。
4. プレートを伸ばす
   1. 手順2.3の説明に従って圧子を潤滑します。
   2. ステージクランプでプレートを傷害装置のステージに固定します。無菌性が必要な場合は、蓋の位置を調整して、培養面を室内の空気にさらさずにプレートを固定します。
   3. 「モーションコントロールVI」を使用してステージをゼロ位置まで下げます(ステップ2.2.4-2.2.6を参照)。ゼロポジションはステップ2.2で決定します。
   4. 「position tracking VI」の「file path」フィールドのファイル名を一意のファイル名に変更し、そのウィンドウの左上隅にある「矢印」ボタンで実行します。
   5. 「移動コントロールパネルVI」の「傷害(mm)」および「傷害時間(ms)」フィールドでインデントの深さと持続時間(通常はそれぞれ1〜4 mmと30 ms、最大深さ5 mm、最小持続時間15 ms)を設定するには、フィールドをクリックして目的の値を入力します。
   6. 「移動コントロールパネルVI」を実行し、「負傷」をクリックしてプレートをインデントします。
   7. 「トップ」をクリックして、ステージを移動の一番上まで移動します。次に、「停止」ボタンでVIを停止し、ドアを開けて負傷装置を無効にします。
   8. 「position tracker VI」に表示されたステージの変位履歴を調べて、指定した最大変位が適用されたことを確認します。グラフを右クリックし、「Excelにエクスポート」をクリックします。「ファイル|保存」と入力してデータを保存します。

3. 膜ストレッチの特性評価

1. 各圧子の上部にあるくぼみを白くペイントして、高速ビデオ撮影のための高コントラストの背景を提供します。注意: 圧子がプレートに接触する部分に圧子の縁を塗装しないでください。
2. ポリ(乳酸)(PLA)を使用して3Dプリントするか、またはそれ以外の方法で、各ウェルにドットを作成するための円筒形のスタンプを製作します。シリンダーを直径5.9mm、高さ12.2mmにし、上部を中心に直径1.5mm、高さ1.0mmの円筒形の突起
を作ります。
3. 血漿は、ステップ2.1で述べたように、プレートを右側を上にして処理し、ウェル内のシリコーン細胞培養表面を60秒間活性化します。
4. プレートをゴム製のパッドまたはその他の柔らかい面に置きます。スタンプの小さな突起(ステップ1.2を参照)を油性マーカーペンのインクで下塗りします。テストするウェルにstampを挿入し、タップしてインクの転写が良好であることを確認します。すべての井戸の前にスタンプを下塗りします。
5. 圧子ブロックを位置合わせし、損傷装置の圧子に注油します(手順2.2-2.3を参照)。Clamp プレートをステージに傷害装置のステージに取り付けます。損傷装置の上に明るい拡散性軸方向光を配置します。
6. 傷害器の上のブームスタンドに、レンズを最小の番号のfストップに設定して、まっすぐ下を向いてハイスピードカメラを設置し、電源を入れます。カメラに接続されているコンピューターでカメラソフトウェアを起動します。フレームレートのドロップダウンメニューで2,000フレーム/秒を選択し、シャッターのドロップダウンメニューで、コントラストの高い画像を生成する最速の露光時間を選択します。点線の井戸の中央に置きます。
   1. 視野が 3 x 4 グリッドに 12 個のウェルが含まれるようにカメラを配置します。
      手記：この視野は、1,280 × 1,024 の画像のスループットと解像度の最適な妥協点を提供します。
7. プレートをゼロ点まで下げます(手順2.2.4-2.2.6を参照)。カメラソフトウェアの録画ボタンをワンクリックすると、「トリガーイン」と表示されます。ポジショントラッカーVIを起動します(ステップ2.4.4)。
8. 明るい拡散アキシャルライトをオンにします。手順2.4.6の説明に従ってプレートをインデントします。
9. 明るい拡散アキシャルライトをオフにします。
10. カメラコントロールコンピュータで、インデントが発生する録画の30〜40ミリ秒のウィンドウを見つけます:カメラソフトウェアの高速ビデオ再生バーの開始矢印と終了矢印をドラッグします。[保存]をクリックし、[ファイル名]フィールドに名前を設定し、[形式]フィールドで[TIFF]を選択して、[保存]をクリックします。
    1. に目を通します。TIFファイルでは、最も引き伸ばされていない状態(開始時)と最も引き伸ばされた状態(ピークインデント)の画像が表示されます。
    2. 両方の画像のドットの高さと幅を測定するには、フィジーを使用して、最小ストレッチとピークストレッチの画像を並べて開きます。デフォルトの長方形選択ツールを使用して、クリック アンド ドラッグして、最もストレッチの少ない画像のドットの周りにボックスを描画します。「Analyze|測定」。
    3. ピークストレッチ画像の同じウェル内のドットについても繰り返します。残りのウェルについても繰り返します。
11. x方向とy方向のラグランジュひずみを次のように計算します:
    
    手記： ここで、E_xxはx方向のラグランジュひずみ、E_yyはy方向のラグランジュひずみ、Xはドットの幅、Yはドットの高さ、_fは最終画像(つまり、ピークインデンテーション画像)、_iは初期画像(つまり、インデンテーション前の画像)を示します。2 つの値を平均して、その井戸内のひずみを決定します。

4. 培養細胞のめっき

1. 滅菌に使用するビンとバラストウェイトをオートクレーブします。
2. シリコン底のプレートを右側を上にして60秒間プラズマ処理します(ステップ1.1を参照)。直ちにプレートを70%エタノールを含む滅菌ビンに15分間沈めます。
3. プレートを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に別々の滅菌ビンに30分間浸します。
4. 井戸からPBSを吸引します。ウェルがプラズマ処理を失うのを防ぐために、一度に1つのプレートのみを乾燥させます.
   注意：シリコンボトムプレートは、ピペッティング時の硬質プレートよりも触覚フィードバックが少なく、ピペットの先端を塞ぐ可能性が高くなります。
5. 滅菌したプレートにウェルあたり100 μLの0.1 mg/mLポリ-L-オルニチン(PLO)を加えます。室温で1時間インキュベートします。
6. ウェルを100 μLの滅菌PBSで2回すすぎ、細胞懸濁液の準備ができるまで2回目の洗浄をウェルに残します。
7. 安全手袋を使用して液体窒素貯蔵庫からhiPSCNsのバイアルを取り出し、ドライアイスの上に置きます。バイアルを37°Cのウォーターバスにすばやく運び、正確に3分間解凍します。バイアルを回さないでください。
8. 滅菌フードで、1mLの血清ピペットを使用して、バイアルの内容物を50mLのコニカルチューブに静かに移します。
9. 空の極低温バイアルを1 mLの室温完全維持培地(培地ベース+サプリメント)ですすいでください。
10. 1 mLの培地を50 mLチューブに1秒あたり約1滴ずつ滴下します。追加しながらチューブを静かに回転させます。8 mLの室温完全維持培地を50 mLチューブに約2滴/秒で加えます。
11. チューブにキャップをして、2〜3回反転させます。血球計算盤で細胞を数えます。細胞懸濁液を 225,000 細胞/mL に希釈するために必要な追加培地の量を計算します。
12. 25mLの血清ピペットを使用して、培地の量(上記で計算)を細胞懸濁液のチューブに静かにピペットで移します。
13. 細胞懸濁液1 mLあたり1 mg/mLラミニンストック10 μLを1,000 μLマイクロピペットで添加すると、細胞懸濁液中に10 μg/mLのラミニンが得られます。ラミニンに使用した先端で一度上下に吸引した後、チューブにキャップをしてチューブを一度反転させます。
14. プレートからPBSを一度に1枚ずつ吸引します。マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLのhiPSCN細胞懸濁液を各ウェルに加えます。ウェルの培養面積は0.33 cm²であるため、面積あたりの細胞密度は67,500細胞/^cm2です。
15. 播種後、プレートを室温で15分間休ませ、付着を促進します。滅菌培養フードのファン振動を避けるために、蓋付きのプレートをラボベンチに置きます。培養物を37°Cで5%_CO2とインキュベートします。
16. 24時間後に全培地交換を行い、ウェルに200μLの完全メンテナンス培地を補充します。2〜3日ごとに100μL /ウェルのハーフメディア交換を行います。

5. 傷つける文化

1. 圧子ブロックを位置合わせし、手順2.2の説明に従ってゼロ位置を見つけます。手順2.3の説明に従って圧子を潤滑します。
2. 「position tracker VI」で変位履歴のファイル名を設定します(ステップ2.4.4)。「モーションコントロールVI」で傷害パラメータを設定します(ステップ2.4.5)。
3. 負傷するプレートをインキュベーターから取り出し、ステージに固定します。蓋の位置を調整して、培養物が室内の空気に触れないようにプレートを固定します。
4. 「モーションコントロールVI」を使用して、プレートをゼロ点まで下げます(ステップ2.2.4-2.2.6)。「position tracker VI」を起動します(ステップ2.4.4)。
5. 移動制御VIを使用してプレートをインデントします(手順2.4.6で説明)。シャムストレッチの場合は、この手順のみをスキップします。
6. ステージを可動域の一番上に戻します (ステップ 2.4.7 を参照)。プレートをインキュベーターに戻します。
7. 変位トレースを検査して保存します(手順2.4.8と同様)。

結果

図1:傷害装置のラベル付き回路図。(A)上面図、(B)アイソメトリック図、(C)正面図、(D)右側面図。縮尺記号は、正投影ビュー(A、B、D)に適用されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
.010 "シリコーンシート	スペシャルティ・マニュファクチャリング・インク	#70P001200010	ポリジメチルシロキサン(PDMS)シート
スパークリーン	フィッシャーサイエンティフィック	#043204
ヌンク256665	フィッシャーサイエンティフィック	#12-565-600	ボトムレス96ウェルプレート
キムワイプ	ユーライン	S-8115
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	#PDC-001-HC
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	シグマ・アルドリッチ	#440140	APTESの
パーチメント紙	レイノルズ	該当なし
ドームライト	CCS株式会社	LFX2-100SW
ドームライト電源	CCS株式会社	PSB-1024VB
アキシャル拡散照明ユニット	ジーメンス	ナーライト DOAL-75-LED	拡散アキシャルライト
ハイパワーLEDアレイ	クリー	XLamp CXA2540	ハイパワーLEDアレイ
LEDホルダー	モレックス	1807200001	LEDホルダー
LED電源	ミーンウェル	HLG-320H-36Bの	定電流電源
FastCam Viewerソフトウェア	フォトロン		カメラソフト
ファストカムミニUX50	フォトロン	該当なし	ハイスピードカメラ
Micro-NIKKOR 105mm F2.8	ニコン	#1455	ハイスピードカメラレンズ
0.1 mg/mL ポリ-L-オルニチン	シグマ・アルドリッチ	#P4597
iセル	セルラーダイナミクスインターナショナル	#NRC-100-010-001
iCell メディア	セルラーダイナミクスインターナショナル	#NRM-100-121-001
iCellサプリメント	セルラーダイナミクスインターナショナル	#NRM-100-031-001
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	#L2020
ボイスコイルアクチュエータ	BEIキムコ	LA43-67-000Aの
光学式リニアエンコーダ	レニショー	T1031-30Aの
サーボドライブ	コプリーコントロール	Xenus XTLの
コントローラ	ナショナルインスツル	cRIO 9024リアルタイムPowerPCコントローラ
cRIOシャーシ	ナショナルインスツル	cRIOの9113
デジタルインプットモジュール	ナショナルインスツル	NI 9411
データ・アクイジション・シャーシ	ナショナルインスツル	NI 9113
LabVIEWの	ナショナルインスツル
hiPSCNの	セルラーダイナミクスインターナショナル

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