方法論記事

局所レーザー損傷を用いたゼブラフィッシュの網膜変性および再生のモデル化

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Conedera, F. M., et al. Müller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、レーザー損傷を使用して成魚の網膜変性を誘発する手順を示しています。レーザーは網膜の光受容体細胞を標的とし、細胞死と変性プロセスを引き起こします。この損傷により、ミュラーグリア(MG)細胞が活性化され、網膜再生を助ける幹細胞前駆細胞への脱分化が起こります。

プロトコル

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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物たち

    6
  1. 〜9ヶ月熟成させたTgBAC(gfap:gfap-GFP)ゼブラフィッシュ167(AB)株を、26.5°Cの温度と14/10時間の明暗サイクルの水中で標準条件下で維持します。

2. 可逆的全身麻酔

  1. 3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩(トリカイン)の原液を、トリカイン粉末400 mgをタンク水97.9 mLとトリス緩衝生理食塩水(TBS)1 M2.1 mLに溶解して調製します。1 M Tris(pH 9)でpH 7.0に調整し、暗所で4°Cで最大1ヶ月間保存してください
    手記：トリカインは、動物の自然な生活条件のように水で調製する必要があり、できれば元のタンク水を使用する必要があります。
  2. ストック溶液をタンク水で1:25に希釈し、すぐに使用してください。
  3. ゼブラフィッシュを麻酔液50mLを入れた10cmのシャーレに入れ、ゼブラフィッシュが動かなくなり、外部刺激に反応しなくなるまで(体重と年齢にもよりますが、約2〜5分)。
  4. レーザー治療のために、各魚をカスタムメイドのシリコンピンホルダーに手で移します(図1A).
    注意！ 魚は水槽の外で麻酔をかけられたままにできるのは最大10分間だけです。
  5. 治療および/または画像検査後に麻酔を元に戻すには、ゼブラフィッシュを水槽の水が入った容器に入れます。
  6. 回復をサポートするには、ゼブラフィッシュを水中で前後に動かして、えらに新鮮なタンクの水の流れを作ります。

3. 網膜のレーザー焦点損傷

>注:532 nmのダイオードレーザーを使用して、ゼブラフィッシュの網膜に焦点光による損傷を与えます。レーザーの実験的セットアップにより、成体のゼブラフィッシュにおける再現性のある限局性網膜損傷の確立が可能になります。

  1. レーザーの出力設定:70mW、空中直径:50μm、パルス幅:100ms.
    注意！ レーザー光線の使用には、適切な個人保護とエリアのラベル付けが必要です。
  2. 治療前に2%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを1〜2滴眼に局所的に塗布し、2.0mm眼底レーザーレンズを使用してレーザー照準ビームを網膜に集束させます
    注意！ヒドロキシプロピルメチルセルロースの滴は粘性があり、えらに付着すると呼吸に問題を引き起こす可能性があります。
  3. 左目の視神経の周りに4つのレーザースポットを配置し、未治療の右目を内部制御として使用します。

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結果

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図1:ゼブラフィッシュ網膜のレーザー損傷の誘発とその後のOCT分析のセットアップ。(A)治療前のレーザーシステムの配置。(A.1) ゼブラフィッシュをシリコンピンホルダーに置き、眼底コンタクトレンズを装着してレーザー光線を照射する直前。(B)イメージング前のOCTシステムの配置。(B.1) OCTによる損傷部位の検出前に、78Dスリットランプレンズの前に置かれたゼブラフィッシュ。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒドロキシプロピルメチルセルロース 2%OmniVision、ノイハウゼン、スイスN.A.メトセル 2%
3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸Sigma-Aldrich、ブーフス、スイスA5040 (英語)トリカイン、MS-222
ビズラス532Carl Zeiss Meditec AG、オーバーコッヘン、ドイツN.A.532 nmレーザー
シリコンピンホルダーHuco Vision AG スイスN.A.それに応じて、滅菌トレイのシリコンピンマットから手で切り取ります。
TgBAC(gfap:gfap-GFP)zf167(AB)株KIT、カールスルーエ、ドイツ15204http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
トリスバッファード生理食塩水(TBS)Sigma-Aldrich、ブーフス、スイスP5912
眼底レーザーレンズOcular Instruments, ベルビュー, WA, USAOFA2-0
型

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