リアルタイム環状アデノシン一リン酸アッセイを用いた匂い物質受容体活性化の測定

要約

出典: Zhang, Y. et al., Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、環状アデノシン一リン酸(cAMP)バイオセンサーと発光検出を使用して、トランスフェクションされた細胞の匂い受容体活性化を測定するためのプロトコルを示しています。この方法は、嗅覚ニューロンにおける受容体-リガンド相互作用とシグナル伝達経路の研究に適用されます。

プロトコル

1. Real-Time cAMP Assayによる刺激と匂い受容体(OR)活性の測定

1. トランスフェクションされた細胞を位相差顕微鏡で観察し、ウェルあたり50〜80%の適切なコンフルエンスを確保し、インキュベーターに戻します。
2. 10 mMのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)と5 mMのグルコースをハンク平衡塩溶液(HBSS)に加えて、刺激媒体を調製します。
3. リアルタイムcAMPアッセイ基質試薬のアリコートを氷上で解凍します。基質試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに-80°C、55μL/チューブで保存してください。プレートごとに1つのチューブを使用してください。
4. 基質試薬55μLとHBSS/HEPES/グルコース溶液2750μLを混合して、2%平衡溶液を調製します。
5. ベンチにペーパータオルの厚い層を広げます。ペーパータオルの上でプレートを逆さまにして優しく繰り返し叩き、トランスフェクション培地が完全に吸収
されるようにします。
6. 各ウェルに50 μLのHBSS/HEPES/グルコース溶液をピペッティングして細胞を洗浄します。
7. 96ウェルプレートからHBSS/HEPES/グルコース溶液を静かに繰り返しタップアウトします。
8. 25 μLの2%平衡溶液を各ウェルにピペットで移し、室温で暗所で2時間インキュベー
トします。
9. ジメチルスルホキシド(DMSO)中の1 M臭気物質ストック溶液を事前に調製し、使用するまで-20°Cで保存してください。
10. インキュベーション時間が終了する前に、臭気剤ストック溶液をHBSS/HEPES/グルコース刺激培地の作業濃度に希釈します
    手記：このステップで調製した臭気剤希釈液の濃度を2倍にして、各ウェルの正しい最終濃度を得る必要があります。
11. 化学発光プレートリーダーを使用し、匂い物質を添加する前に、プレートの基礎発光レベルをウェルあたり1000 msの速度で2回連続して測定します。
12. プレートリーダーからプレートをすばやく取り外し、各ウェルに25μLの臭気剤希釈液を追加し、すぐにすべてのウェルの連続発光測定を30分以内に20サイクル開始します
    手記：同じプレートで異なる臭気物質および/または同じ臭気物質の異なる濃度を使用する場合は、隣接するウェルを汚染しないように慎重にピペットで動かしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMSOの	シグマ	D2650
GloSensor cAMP試薬	プロメガ	E1290
HBSS、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし	ギブコ	14175095
ヘープス	ハイクロン	SH30237
ムスコーン	サンタクルス	SC-200528
ムスクチベット	シグマ・アルドリッチ	S359165
PBS、カルシウムまたはマグネシウムなし	セルグロ	21-040-履歴書
0.2 mL PCRチューブ	アクシゲン	PCR-02-Cの
1.5 mL Eppendorf	エッペンドルフ
15 mL 17 mm x 120 mm コニカルチューブ	BDファルコン	352096
8ウェルおよび/または12ウェルマルチチャンネルピペットマン	エッペンドルフ
96ウェル平底白細胞培養プレート	グライナー	655098
100 mm x 20 mm細胞培養ディッシュ	BDファルコン	353003
Infinite F200 プレートリーダー	テカン