イオン選択的およびイオントフォレーシス微小電極を用いた脳切片の細胞外空間の特性評価

要約

出典:Odackal, J., et al.テトラメチルアンモニウムによるリアルタイムのイオントフォレーシスにより、脳の細胞外空間の体積分率と曲がり角を定量化します。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、イオン選択性およびイオントフォレーシス微小電極を使用して電気信号を測定および比較することにより、脳スライスの細胞外空間を特徴付ける方法を示します。このプロセスは、スペースの体積分率とねじれの程度を決定するのに役立ちます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 脳スライスにおけるリアルタイムイオントフォレーシス

1. 厚さ400μmの脳スライスを記録室に置き、流れる人工脳脊髄液(ACSF)に完全に浸されていることを確認します。水彩絵の具ブラシを使用してスライスを配置し、グリッドでそっと固定します。
2. イオントフォレーシス微小電極とISMの両方を、脳スライス上の関心フィールドより上に移動します。両方を流れるACSFに浸しますが、スライスの上に置きます。
3. リファレンスチャンネルとイオン検出チャンネルの両方の電圧を「0」mVにオフセットします。両方のチャネルの電圧が安定するまで待ちます。チャートレコーダーで、ISMのイオン検出チャネルで測定された電圧をマークします。これを使用して、ワンダのベースライン V パラメーターを計算します。
4. ISMとイオントフォレーシス微小電極をスライスの深さ200μm、互いに120μm離して配置します。微小電極を脳スライスに移動させた後、信号が安定するのを待ちます.
   手記： イオントフォレーシス微小電極に印加されるバイアス電流は、テトラメチルアンモニウム(TMA)の小さな蓄積を引き起こします。録音を早すぎて、信号の蓄積を過小評価することはよくある間違いです。
5. チャートレコーダーで、ISMのイオン検出チャネルのブレインスライスで測定された安定化電圧をマークします。ステップ8.3とステップ8.4で測定したTMA信号の電圧差を計算し、この値をWanda GUIの測定電極ボックスの「ベースラインV(mV)」フィールドに入力します。
6. GUIの左側で、すべての実験パラメータが正しく記録/入力されていることを確認します。「Medium」を「Brain」に、「Transport number」をステップ7.4でイオントフォレーシス微小電極について計算した平均値に、「Temperature」をスライスを含む浴の温度に設定します
   注意: Vは、測定セットごとに記録する必要があります。ベースラインVは、WandaによってベースラインC(mM)パラメータ(つまり、脳組織内のTMAの濃度)に変換されます。
7. 「取得」をクリックして録音を開始し、完全な録音を行えるようにします。TMA信号がベースラインに戻るまで待ってから、新しい録音を集録します。
8. 選択した脳の位置から微小電極を取り外す前に、2〜3回連続して録音します。各録音の直前に、測定した温度をWandaソフトウェアに入力します。
9. 両方の微小電極をスライスの表面に斜めに戻します。両方をスライスから少なくとも50μm上まで上げます。チャートレコーダーを使用して、現在測定されたVとステップ8.3の測定値との間の変化を確認します。
10. ISMとイオントフォレティック微小電極の先端をx軸、y軸、z軸の中央に配置します。間隔の変更がある場合は、マイクロマニピュレータ制御ボックスの表示から取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ISM用アンプ	ダガン	モデルIX2-700デュアル細胞内プリアンプ	N=0.1(基準バレル用)およびN=0.001(イオンバレル用)ヘッドステージを備えたイオンおよび基準電圧増幅器
生物学的化合物ミスクロスコープ(4倍および10倍対物レンズ付き)			微小電極の先端をチッピングし、微小電極を検査するため、AmScopeなど、さまざまなサプライヤー
ホウケイ酸シータ毛細管ガラス管	ハーバード大学装置	ワーナー・インスツルメンツ TG200-4 型番 #64-0811	イオン選択性微小電極およびイオン導入微小電極用のダブルバレルガラス管、外径2.0 mm、内径1.4 mm、セプタム0.2 mm、長さ10 cm
チャートレコーダー			テトラメチルアンモニウム標準試料の較正中およびRTI実験中にイオン選択性微小電極上の電圧を連続的に記録する;例えば、Kipp & ZonenタイプBD112デュアルカネルチャートが記録され、再生品が利用可能
商用ソフトウェア	MathWorks の	MATLAB、データ取得ツールボックス	Wanda および Walter プログラムを使用したデータ取得および解析用。アカデミックライセンスが利用可能です。
目の保護ゴーグル	漁夫
固定ステージ複合顕微鏡	オリンポス	BX51WI	固定ステージを持つ他の複合顕微鏡も使用可能
鉗子	ファインサイエンスツール	#11251から10	ガラスキャピラリーをチップ化する。デュモンド#5、できれば使用し、細かい作業には不要
イオン導入ユニット	ダガン	ION-100 および PS-100	ION-100は、シングルチャネルイオントフォレーシスユニット+/-130V準拠です。PS-100は外部電源です。代替案:例:Axon Instruments(現在のMolecular Devices)製のAxoprobe-1A、生産終了、再生ユニット(eBayおよびその他のサイト)の入手可能性を確認する
微小電極ホルダー	WPIの	M3301EH	イオン選択性マイクロエレトロードをシラン化のためにプレハブで保持し、イオン選択性バレルの先端を液体イオン交換体で充填すること。WPIは、このホルダーの2つのバージョン、クリアM3301EHとブラックM3301EHを販売しています。私たちの経験では、透明なM3301EHは黒いM3301EHよりも頑丈に見えます。
マイクロマニピュレーター	成茂	MM-3	イオン選択性微小電極をシラン化中にプレハブで配置し、イオン選択性バレルの先端を液体イオン交換体で充填する;良好な動作状態の任意の3軸マイクロマニピュレータで置き換えることができる
対物レンズ 5倍ドライ	オリンポス	MPlan N
対物レンズ10倍水浸漬	オリンポス	UMPlan FL N	10倍対物レンズは水浸、開口数は0.3、作動距離は3.3 mm
固定ステージ顕微鏡用のプラットフォームとXY平行移動ステージ	EXFO	ジブラルタル・バーレー	プラットフォームはスライスチャンバー、マイクロマニピュレーター、アクセサリーを保持し、X-Y並進ステージは記録の安定性を損なうことなく顕微鏡を動かします
正確なX、Y、Z位置決めを備えたロボットマイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	MP-285	イオン選択性微小電極とイオン導入微小電極を別々に保持するには、2つのミルコマニピュレーターが必要です。マイクロピペットを間隔を空けて並べて接着することも可能です(テキストを参照)。
ローパスフィルター付き信号調整ユニット	Axon インスツルメンツ	CyberAmp 320 または 380	製造元からは入手できなくなりましたが、E-Bayから入手できる場合があります。代替製品:Cygnus TechnologyのFLA-01フィルター/アンプなど。これは、マルチポールベッセルフィルターを使用して10 Hzで最小カットオフを持つシングルチャンネル機器ですが、必要に応じて、会社はそれをより低いカットオフ周波数(2 Hz)に変更する用意があります。
シルバーワイヤー	A-Mシステムズ	#7830	直径0.015インチ、裸(コーティングなし)
スライスチャンバー	ハーバード大学装置	ワーナーモデルRC-27L	これは水中スライスチャンバーです。インターフェーススライスチャンバーは使用しないでください
実体顕微鏡			イオン選択性バレル先端のシラン化および液体イオン交換体充填用、水平実装、各種サプライヤー
塩化テトラメチアンモニウム(TMA)	シグマ・アルドリッチ	T-3411	5 Mソリューション;注意:急性毒性(経口、経皮、吸入)、発がん性、水生環境に有害、詳細については、Sigma-Aldrich安全情報を参照してください

シリーズ の