アミロイドβペプチド注入によるアルツハイマー病ラットモデルの確立

要約

出典:Xiaoguang, W., et al.複合アミロイドベータタンパク質の脳室内注射によるラット動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、アミロイドベータペプチド、塩化アルミニウム、および海馬領域での有毒なアミロイドプラーク形成をまとめて助ける神経炎症性成長因子を注入する手順を示しています。これは、アルツハイマー病の特徴であるラットの記憶障害を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 外科的処置

>注:20匹の雄Sprague-Dawleyラットに複合アミロイドβタンパク質(Aβ)を側脳室と視床前核にマイクロインジェクションし、複合Aβ治療群として指定しました。別の20匹のラットが同じ手術を受けましたが、0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)生理食塩水マイクロ注射を受け、偽手術群に指定されました。

1. ラットを吸入により100%イソフルランで麻酔し、脳定位固定装置に拘束します。
2. 手術用ハサミで頭の頂点の毛皮を剃り、ヨードフォアで消毒します。次に、頭に使い捨ての手術用タオルを覆います。
3. 外科的ビスツアーとハサミで縦縦の頭蓋骨の中央に沿って頭の皮膚を切開します。
4. 皮下組織と筋膜を分離し、頭蓋骨の頭蓋骨を滅菌乾燥綿で拭いて出血を止め、マーカーペンでブレグマに印を付けます。
5. Bregmaを起点としてRat Brain Stereotaxic Mapを参照し、組換えヒト形質転換成長因子-β1(RHTGF-β1)を注入するための前背視床核(ad)(後部(P):束縛部から2.0mm、側方(L):正中線から1.4mm)の3点を印をつけ、1本のネジ、側脳室(LV)領域(後部(P): ブレグマまで0.8mm。アミロイドβタンパク質25-35(Aβ25-35)と三塩化アルミニウム(_AlCl3)を注入するための横方向(L):正中線まで2.0mm)、および第2ネジ固定場所(前(F):ブレグマまで2.0mm、横方向(L):正中線まで1.5mm)。
6. 頭蓋骨の上の3つのポイントで指定された柔軟な骨ドリルを使用して、直径1mmの3つの穴を静かにドリルします(1.5.ステップ)。脳組織を刺さないように、必要以上に深くねじ込まないでください。
7. 出血を止め、滅菌乾燥綿で頭蓋骨の表面を繰り返し清掃します。
8. マイクロインジェクションポンプに連結した針を脳に4.6mmの深さで挿入し、1μLのRHTGF-β1(10ng)をAD領域に優しく注入します。注射後2分間針を留置し、ゆっくりと針を引き抜きます。
9. 広告のポイントで指定された頭蓋骨に2本のネジを固定し、頭蓋骨の2番目のネジ固定場所(1.5ステップで指定)を小さなドライバーで固定します。脳組織を刺さないように、必要以上に深くねじ込まないでください。
10. カニューレ埋め込みシステムを組み立て、高圧消毒後にダミーカニューレをガイドカニューレに挿入します。
11. ラットの定位固定装置のカニューレホルダーの助けを借りて、頭蓋骨の穴を通して4.6mmの脳へのステンレス鋼チューブガイドカニューレを脳
に挿入します。
12. 義歯基材と義歯基水に1mLあたり1.5gの割合で混合し、ガイドカニューレのプラスチック台座を覆うようにペーストを入れ、ガイドカニューレを固定するための2本のネジを入れ、皮膚の切開部全体を覆って皮膚感染を防ぎます。
13. 手術の2日目に、ラットは小動物麻酔器を使用してイソフルラン吸入で麻酔されました。ダミーカニューレを引き出し、ガイドカニューレに内部カニューレを挿入し、固定ネジをねじ込んで内部カニューレを固定します。
14. マイクロインジェクションポンプと内部カニューレをつなぐポリエチレンパイプをセットし、注入速度を1μL/minに調整し、Aβ25-35または_AlCl3をLVにマイクロインジェクションします。
15. イソフルラン麻酔下で、Aβ25-35を毎日4μg(1μL)を午前中に14日間、午後に5日間、毎日3μLのAlCl3(1%)をマイクロインジェクションします。
16. 注入終了後5分待ってから、内部カニューレをゆっくりと引き出し、ガイドカニューレに再びダミーカニューレを挿入します。
17. 15日目の術後(Aβ25-35の最終注入日)に、カニューレ留置系を解体します。義歯の基材を手術用ハサミや鉗子でしっかりとそっと取り除き、2本のネジを緩めてガイドカニューレを引き出し、ベタジンで傷口を消毒します。頭蓋骨の穴を骨セメントで埋め、簡単な中断縫合法を使用して皮膚を縫合します。
18. 偽操作群で同じ操作を行い、0.1% DMSO生理食塩水をマイクロインジェクションします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Sprague-Dawleyラット	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, 中国	SCXK(京) 2012-0001	300〜350グラム
可動式小動物麻酔	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	R580
脳定位固定装置	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	68001
フレキシブル骨ドリル	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. 中国	BW-sD908
透過型電子顕微鏡	Japan Co., Ltd. 日本	JEM-1400
2チャンネルマイクロインジェクションポンプ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	RWD202
EMミクロトーム	Hitachi Co., Ltd. 中国	H-7650
ダミーカニューレ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
ガイドカニューレ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62101	0.D.0.40mm/M3.5
内部カニューレ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62201	0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5
ナットを締めます	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62501	0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
固定ネジ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62514	M1.2×L2.0mm(100BAO)
ドライバー	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62999	45 * 1ミリメートル
PEチューブ	RWD Life Science Co., Ltd. 中国	62302
アミロイドβ 25-35	シグマ・アルドリッチ社(米国	SCP0002-5MG
組換えヒトトランスフォーミング成長因子-β1	PeproTech Inc. 米国	100-21
三塩化アルミニウム	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. 中国	3011080
リン酸亜鉛歯科用セメント	工場上海医療器械Co.、株式会社の歯科材料中国	201311

の 年 ) の