動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
C57BL/6 (H-2b) 雌マウス、8週齢を購入し、C57BL/6 AQP4-/-マウスをA. Verkmanから提供した。
1. AQP4ペプチドによるマウスの免疫
- フロイントのアジュバント(CFA)ワーキングストック一式を準備します。
- 結核菌(H37Ra)の乾燥調製物を乳鉢と乳棒を使用して細かく挽きます。
- 粉砕したH37Raを不完全なフロイントアジュバントに添加し、最終濃度を4 mg/mLにします。CFAは4°Cで最大6ヶ月間保存できます。
- 凍結乾燥抗原(Ag)AQP4ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、最終濃度1 mg/mLにします。4°Cまたは氷上で維持します。
- CFA/ペプチドエマルジョンを含む活栓で結合した2つのルアーロックシリンジのアセンブリを準備します。
- プランジャーなしのガラス製ルアーロックシリンジを、2つのオス型ルアーロック接続部を備えた3ウェイナイロンストップコックに取り付けます。レバーをシリンジに切り替えて、ストップコックを閉じます。シリンジの開放端を上にして、シリンジが試験管として機能するようにします。これをチューブラックに置くと、安定性が向上します。
- CFAの作業用ストックとAg溶液をボルテックスします。1:1の容量のペプチド/ CFAをオープンシリンジに加えます。マウス1匹につき200μLのCFA/Ag(4×50μL)が必要です
手記：通常、約1mLの調製物が活栓で失われるため、免疫に利用できる量が減少します。したがって、これを必要な総体積の計算に組み込むことが重要です.
例:マウス5匹の免疫の場合:(200 μL/動物×5匹)+ 1 mLの追加容量= 2 mLの合計CFA/Agが必要です。
- ガラスプランジャーをシリンジに挿入し、所定の位置に保持したまま、活栓が上を向くようにシリンジを反転させます。ストップコックレバーを未使用のメス接続に切り替えます。シリンジから余分な空気を取り除くために、ガラスプランジャーに慎重に圧力をかけます。液体は、ストップコックの2番目のオス型ルアーロック接続部を満たします。
- 2番目のガラスシリンジ(プランジャーが完全に挿入されている)をストップコックの2番目のオスルアーロック接続に取り付けます。これは、余分な空気をできるだけ含まない活栓に接続された2つのガラス注射器の閉鎖システムである必要があります。
- エマルジョンを作成するには、プランジャーを押して2つのシリンジの間に液体を交互に通過させて約2分間混合します.氷上でシリンジを約10分間冷やします。調製物の粘度に明らかな変化が生じるまで冷却と混合を繰り返し、非常に硬い白いエマルジョンが得られます。エマルジョンを含むシリンジを4°Cで冷蔵するか、氷上で保持します。
- すべてのエマルジョンを1つのガラス製ルアーロックシリンジに移し、空のガラス製シリンジを取り外して、注射用の1mLルアーロックシリンジと交換します。新しいシリンジにエマルジョンを入れ、ストップコックから取り出して針(25G x 5/8)を取り付けます。
- エマルジョンの一貫性を「水でテスト」します。エマルジョンを一滴の水に一滴排出します。エマルジョンは分散してはならず、注入に適していることを示しています。
- エマルジョンが分散した場合、注入の準備ができていません。液体をガラスシリンジに戻し、混合を続け、エマルジョンが固くなるまで再度冷やします。
- 適切な一貫性が達成されるまで、エマルジョンを再度テストします。
- ドナーAQP4-/-マウスに皮下(s.c.)にAQP4ペプチドを含むエマルジョンを注入します。.各マウスに50 μL s.c.注射を4回行います(合計200 μL(ペプチド100 μg))。4つの部位には、鼠径リンパ節(LN)に流れ込む下腹部の両側と、各脇の下の内側にある胸壁の両側が含まれ、腋窩LNに流れ込みます。養子縁組の移管には、レシピエントマウス1匹につき1〜2匹の免疫ドナーマウスが必要です。
2. T細胞の培養と炎症誘発性T細胞の分極
- 免疫後10〜12日で、マウスからLNを採取します。
- 製氷皿で、セルストレーナー(メッシュサイズ70μm)を取り付け、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)と100U / mLペニシリン-100μg / mLストレプトマイシン(ペン連鎖球菌)(RFPS)を含む冷やしたロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地を含む60mmのペトリ皿を準備します。
- CO2への曝露によりマウスを安楽死させ、続いて頸部脱臼を行います。マウスを70%エタノールに浸し、各フットパッドを解剖ボードに固定します。
- 鼠径部から首まで、そして各脚に正中線の皮膚切開を切ります。皮膚を腹膜から引き離し、ボードにピンと張って固定します。鼠径部と腋窩のLNを解剖し、RFPSを含むペトリ皿に氷上に置きます。
- 養子移植実験では、同じ免疫群内のすべての動物由来のLNを組み合わせます。Vβ使用量のフローサイトメトリー解析では、LNを個々の動物から分離します。
- LNを含むセルストレーナをRFPSを含む50mLの遠心チューブに置きます。滅菌済みの5 mLシリンジプランジャーの平らな端を使用してLN細胞をストレーナーに押し込み、20〜30 mLのRFPSで洗浄して細胞の回復を促進します。培養の時間まで、処理全体を通してLN細胞を氷上に保持します。
- 2回洗浄し、393 x gで5分間遠心分離します。2回目の洗浄後、LN細胞をT細胞培地(TCM)に再懸濁します。TCMには、10%熱不活化FBS、292μg/mLのL-グルタミン、110μg/mLのピルビン酸ナトリウム、55μMの2-メルカプトエタノールとペンストレプを含むRPMIが含まれています。通常、ドナーマウスあたり5mLのTCMが使用されます。
- LNセルをカウントします。予想される収量は、免疫マウスドナーあたり約3-6 x 107 LN細胞です。
- 養子縁組のための分極培養を設定します。
- TCM中の10 μg/mL Ag、20 ng/mL組換えマウスインターロイキン(IL)-23、および10 ng/mL組換えマウスIL-6を含む5 x 106 LN細胞/mLのTh17分極培養液を調製します。
- あるいは、Th1分極のために、TCM中の10 μg/mL Agおよび10 ng/mL組換えマウスIL-12を用いて、5 x 106 LN細胞/mL/mLの培養物を調製します。
- 偏光培養混合物のウェルあたり2 mL(1 x 107細胞)を12ウェルプレートに加えます。2〜4匹のドナーマウスのLN細胞は、1つの12ウェルプレートを満たします。加湿インキュベーターで5%CO2を含む37°Cで培養物を72時間維持します。
- 48時間および72時間で活性化する培養中のLN細胞を視覚的に確認します。活性化された細胞は広範なクラスターを形成し、T細胞のサイズが大きくなり、より多形性になります。代謝の増加は、培地のpHの低下を引き起こし、桃からオレンジに変化します。pHが十分に低く、培地が黄色くなる場合は、残りの24時間で細胞への毒性を防ぐために、新鮮なTCMを1mL追加します。
- 養子縁組の譲渡に進みます。
>3. 病原性AQP4特異的T細胞の養子導入
>注:この手順は、セクション2.5:T細胞培養と炎症誘発性T細胞分極に従います。
- 分極した細胞を12ウェルプレートから回収するには、ピペッティングで上下させて取り外し、50 mLチューブに移します。注射まで氷の上に保ちます。
- 細胞をカウントし、冷たいPBSで2回洗浄し、PBSで1 x 108細胞/mLの懸濁液を調製します。通常、1時間以内に細胞を注入します。
- 細胞を渦巻かせて穏やかに混合し、注入時に1mLシリンジに移します。200 μLの細胞(2 x 107)を尾静脈を介して各マウスに静脈内(i.v.)投与します。
- その日と2日後に、200 μLのPBSで希釈した百日咳菌毒素200 ngを各レシピエントマウスi.p.に注入します。臨床疾患の兆候がないかマウスを毎日監視します。
