胚性マウス消化管におけるニューロン集団の免疫蛍光染色

要約

出典: Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunostaining to Visualize Mouseine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオでは、胚性マウスの消化管の免疫染色を行い、免疫蛍光法と共焦点顕微鏡を用いてニューロン集団の分布を可視化・解析する様子をご覧いただけます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫染色のプロトコル

1. サンプルを30%ショ糖で保存している場合は、ロッキングプラットフォーム上で1x PBSで20分間3回すすぎます。
2. GIトラクトをロッキングプラットフォーム上のブロッキング溶液にRTで1時間入れます。
3. ブロッキング溶液を取り出し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を適量に希釈したGIトラクトと、ロッキングプラットフォーム上で室温で4時間またはO/Nで4°Cでインキュベートします。1:1,000 希釈のヒト抗 Hu 抗体 (患者から採取した血清)、1:1,000 希釈のニワトリ抗緑色蛍光タンパク質 (GFP) 抗体、1:100 希釈のヤギ抗 ChAT 抗体を使用します><。 手記：私たちは、患者から局所的に得られたヒト抗Hu抗体を利用します。しかしながら、抗Hu抗体は市販されており、例えば、マウス抗Hu(1:500希釈で使用
)が挙げられる。
4. 消化管を1x PBSで5分間3回すすぎ、次にロッキングプラットフォームのRTで1時間すすぎます。
5. 1x PBSを、ロッキングプラットフォーム上でブロッキング溶液で1:500に希釈した二次抗体と交換し、室温で4時間、または4°CでO / Nします。Dylight、ロバ抗チキンCy2、ロバ抗ヤギCy5などのロバ抗ヒトアミン反応性色素を使用してください。マウス抗Hu抗体を使用する場合は、1:500に希釈したロバ抗マウスアミン反応性色素405.
   を使用してください。 手記： 内因性GFPおよびtdTomatoの発現強度と免疫染色の透明度は、発達年齢とともに増加します。通常、150 μlの染色溶液を含む0.2 mLチューブで胚性腸を個別に免疫染色します。これは、抗体の使用量を減らし、組織の効率的な染色を確実にするためです。
6. 消化管を1x PBSで5分間3回すすぎ、次にロッキングプラットフォームのRTで1時間すすぎます。
7. DAPIを塗布した蛍光封入剤を数滴スライドガラス上に置きます。GIトラクトを蛍光封入培地に浸し、組織の上に直接カバーガラスを添加します。蛍光封入剤-Gは、半永久的なシールを提供する水溶性化合物です
   手記： グリセロールベースの封入剤であるVectashieldなどの蛍光封入剤を使用し、抗体の退色や光退色を防ぎます。これらの製品はどちらも、組織を4°Cで長期間保存することを可能にします。
8. 共焦点顕微鏡を使用して各蛍光色素の画像をキャプチャします。表1で採用されている蛍光色素とフィルターの励起波長を使用してください。
9. 画像のキャプチャに使用される共焦点のタイプに応じて、適切なソフトウェアを使用してコンピューター支援画像分析を実行します。

表1: 共焦点イメージングの励起波長、蛍光色素、およびフィルター。励起波長、検出可能な蛍光色素、および使用されるフィルターが提示されます。この情報は、マルチカラー免疫蛍光法用の二次抗体の組み合わせを選択する際に使用できます。

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>励起			エミッション
レーザーライン	蛍光色素タイプ	例	光電子増倍管	フィルターオプション
408 nm	青い	Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Coumarin 30、DAPI、Hoechst、Pacific Blue、ほとんどの量子ドット	1	BP425-475 nm
488 nm	緑	Alexa Fluor 488、ATTO 488、Calcein、Cy2、eGFP、FITC、Oregon Green、YO-PRO-1	2	BP500-550 nm
561 nm	赤い	Alexa Fluor 546、555、568、594、Cy3、DiI、DsRed、mCherry、フィコエリトリン(PE)、ヨウ素プロピジウム(PI)、RFP、TAMRA、tdTomato、TRITC	3	BPの570-620 nm
638 nm	ファーレッド	Alexa Fluor 633および647、アロフィコシアニン(APC)、Cy5、TO-PRO-3	4	BPの663-738 nm

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水	オキソイド	BR0014G
ウシ血清アルブミン	漁夫	BP1605
トリトンX-100	シグマ	X100
蛍光スコープ	ニコン	SMZ-18ステレオスコープ
1.5 mL Eppendorf	VWRの	20170-038
フルオロマウント-G	SouthernBiotech、アラバマ州バーミンガム	0100-01
スライドガラス	漁夫	12-550-15
カバーガラス	VWRの	16004-330
共焦点顕微鏡	ニコン	ニコンA1
ニコンエレメンツ	ニコン

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