$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 動物モデル
ヘミジガス- Tg(Gfap-luc+/-)マウス(ホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウス)とヘミジガスTg(M83+/-)マウス(家族性A53T変異を持つヒトα-シヌクレインを発現するトランスジェニックマウス)を交叉して、ヘミジガスバイジェニックTg(M83+/-:Gfap-luc+/-)マウスを作製します。
- ヒトα-シヌクレインをコードする導入遺伝子の存在について、リアルタイムのポリエメラーゼ連鎖反応(PCR)とホタルルシフェラーゼの標準PCRを用いて、子孫の遺伝子型を決定
づけます。
- 6〜8週齢で動物に接種します。
2. 接種材料の準備
- 20 mM Tris-HCl(pH 7.2)に150 mM NaClを含むTris-buffered saline(TBS)バッファーに、A53T変異を持つ単量体組換えヒトα-シヌクレインを調製します。
- 3 μg/μL のモノマー組換えヒト α-シヌクレインをオービタルシェーカーで 800 rpm および 37 °C で 5 日間攪拌することにより、接種用の線維性α-シヌクレインを調製します。
- フィブリル集合体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、腹腔内接種の最終濃度を1 μg/μLにします。
- アルファ-シヌクレイン線維をロッドソニケーターで1分間(0.5秒の持続時間を40パルス、各パルスの間に1秒の一時停止を挟み、振幅を50%に設定)氷上で断片化します。クロスシードによる汚染を避けるために、清潔な超音波処理プローブを使用して異なる接種物を調製してください。
3. 腹腔内注射
- 腹腔内注射の場合、麻酔室ですぐにイソフルラン/酸素を吸入し、流速 2 L/min を使用し、気化器を 2% に設定して動物を麻薬化します。動物のつま先をつまんで、適切な麻酔を確保するために後肢を引っ込めないことを確認します。
- 27 Gの使い捨て皮下注射器に、50 μLの超音波処理されたα-シヌクレインフィブリルまたはPBSを満たします。.
- マウスの腹膜に直接注入し、頭を研究者から遠ざけ、約45°下向きにして動物を背側位置に保持することにより、腹壁の後ろにある小腸または盲腸を貫通しないようにします。動物が麻酔から回復するまで動物を監視します。