トランスジェニック線虫におけるプリオン様タンパク質の細胞間拡散をモニタリングするためのタイムラプスイメージング

要約

出典: Nussbaum-Krammer, C. I., et al. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、赤色蛍光タンパク質でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現するC.エレガンスのin vivoイメージングの手順を示しています。このプロトコールでは、アガロースパッド上に線虫を固定化して、タイムラプス共焦点顕微鏡法を行い、細胞内および細胞間のタンパク質の凝集と輸送を明らかにします。この手法は、神経変性疾患に関連するタンパク質凝集を研究するために重要です。

プロトコル

1. In vivoタイムラプスイメージングによるプリオン様タンパク質の細胞内拡散のモニタリング

>注:標準的な方法に従ってC.エレガンスの野生型(WT)(N2)およびトランスジェニック系統を育て、栽培温度を慎重に管理してください。

1. プリオン様タンパク質を発現するC.エレガンスのトランスジェニック系統を作製し、単量体の赤色蛍光タンパク質(mRFP)をタグ付けします。
2. 標準的な方法に従って、産卵または漂白によって同期した個体群を準備します。
   1. 産卵による同期
      1. 10〜20匹の妊娠した成虫を皿に移し、1〜2時間産卵させます。
   2. 漂白による同期
      1. 妊娠した成人の同期していない集団を収集し、アルカリ性次亜塩素酸塩溶液(250 mM水酸化ナトリウム(NaOH)および1:4(v / v)希釈した市販の漂白剤を水(H₂O))で漂白します。.卵をM9緩衝液(21 mM Na₂HPO₄・7H₂O(リン酸二ナトリウム七水和物)、22 mM(リン酸二水素カリウム)KH₂PO₄、86 mM塩化ナトリウム(NaCl)、1 mM MgSO₄・7H₂O(硫酸マグネシウム七水和物)、dH₂Oを最大1 Lまで加える)で卵を2回(218 x gで1分間)洗浄します。
      2. 20 °Cで一晩(O/N)穏やかな攪拌を行いながらM9緩衝液で孵化させます。食糧源がない場合、ワームの発生はL1段階で停止し、同期した個体群が残ります。OP50 E. coli細菌を播種した新鮮な線虫増殖培地(NGM)プレートにL1を移し、子孫を所望の年齢まで発育させます。
3. 2%アガロースパッド(H₂O中)を顕微鏡スライド上に調製します。
   1. スペーサーとして使用するために、ラベリングテープを全長にわたって貼り付けた2つの顕微鏡スライドを準備します。それらの間に3番目の顕微鏡スライドを置きます。
   2. 2%アガロースをH₂Oに溶解し、クリーンスライドに1滴ピペットで移します。
   3. 寒天滴の上に、他の3つのスライドに対して垂直に4番目のスライドを置きます。それをそっと押し下げて、パッドをラベリングテープと同じ厚さに平らにします。
   4. 1分間乾かしてから、スペーサーを取り外し、スライドをそっと引き離します。寒天パッドはそのうちの1つにくっつきます。
4. ~10 μl の麻酔薬 (M9 バッファー中の 2 mM レバミゾール) をパッドにピペットで移し、プラチナ ワイヤー ピックを使用して ~10 匹を移します。カバースリップ(~22 x 22 mm)で覆い、1時間以内に画像を撮影します。
5. あるいは、長期間にわたって映画を取得するため、または動物の動きの可能性をさらに減らすために、麻酔薬とビーズ固定の組み合わせを使用します。
   1. 記載されているように10%アガロースパッド(M9バッファー中)を調製し、3 μlのナノスフィアサイズ標準溶液(ポリスチレンビーズ、100 nm)と3 μlの麻酔薬(M9バッファー中の4 mMレバミゾール)に線虫を加えます。カバースリップでやさしく覆います。乾燥を防ぐため、カバーガラスをVALAP(ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスの等量の混合物)で密封します。
6. 共焦点顕微鏡を使用して固定化された線虫を画像化.
   注:結果は、EM-CCDカメラとMetaMorphなどの顕微鏡自動化および画像解析ソフトウェアを備えたスピニングディスクAF共焦点顕微鏡を使用して取得されますが、以下の詳細を概説していますが、他の同等の共焦点イメージングシステムも使用できます。
   1. 63Xまたは100X / 1.4NAオイル対物レンズを使用し、ワームを含む顕微鏡スライドを顕微鏡スライドホルダーに入れます。
   2. ソフトウェアを起動します。mRFPイメージング用のレーザー出力とフィルターを調整します。561 nmレーザーを10 %のパワーで使用し、蛍光フィルター>600 nmで使用します。
   3. 「MultiDimensional Acquisition」を開きます。「メイン」タブで、「タイムラプス」と「ジャーナルの実行」(ハードウェアオートフォーカス:オフ)のチェックボックスをオンにします。
   4. 「保存」タブで、ファイルを保存するディレクトリフォルダを選択または作成します。ファイルに名前を割り当てます。
   5. 「Wave Length」タブで、適切な照明を選択し、露出とゲインを調整します。「YokoQuad Red」(またはmRFPイメージングの同等の照明設定)を、個々のサンプルに応じて、露光が100〜300ミリ秒、カメラゲインが100〜300の「YokoQuad Red」(またはmRFPイメージングの同等の照明設定)を使用します(ライブ画像を使用して評価)。
   6. 「タイムラプス」タブで、「タイムポイント数」=301、「期間」=5分、「時間/インターバル」=1秒を選択します。
   7. 「ジャーナル」タブで、ジャーナル:「AFC SET Z HOLD」と「AFC Return to Z HOLD」、タイプ:「スペシャル」(2回)、初期ポイント:「時点の開始」と「終了時点」を選択します。このオートフォーカスオプションは、同じセクションを長時間にわたって撮影するために重要です。
   8. 設定が完了したら「取得」を押すと、タイムラプス動画は別々のTIFFファイルとして保存されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
ナノスフィアサイズ標準 100nm	サーモサイエンティフィック	3100エー
レバミゾール	シグマ	L-9756
備品
Sorvall Legend XTR冷蔵遠心分離機、120VAC	サーモサイエンティフィック	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
96ピンリプリケータ	サイオノミックス		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro大容量、インキュベーションシェーカー	デジラボ		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi試薬ディスペンサー	タイタートレック		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 自動ワークステーション	ベックマン・コールター		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44シェーカー	ニューブランズウィック		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	ライカ		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BデジタルCCDカメラ	浜松		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
スピニングディスクAF共焦点顕微鏡	ライカ		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60カメラ	テレダイン・ダルサ		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
ソフトウェア
MetaMorph 顕微鏡自動化および画像解析ソフトウェア	分子デバイス		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
浜松SimplePCI画像解析ソフトウェア	マイヤー・インスツルメンツ		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
イメージJ	NIHの		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
ImageJ 用の wrMTrck プラグイン			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C.エレガンス株
N2 (WT)	カエノーラブディティス遺伝学センター(CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570

シリーズ