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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の生産と精製
>注:rAAVベクターの生成と精製は、Leuven Viral Vector Core(LVVC)によって行われました。
- 簡単に説明すると、DMEM 培地 2% ウシ胎児血清中で、25 kD 直鎖ポリエチレンイミン 150 nM NaCl トランスフェクション溶液と 3 種類のプラスミドを 1:1:1 の比率で使用して、サブコンフルエント低 (<50) 継代付着性 HEK 293T 細胞をトランスフェクションします。5% CO2 中で 37 °C で 24 時間インキュベートした後、培地を新鮮な DMEM 培地 2% ウシ胎児血清と交換します><。
手記：プラスミドには、AAV7血清型のコンストラクト、CMVie増強シナプシン1プロモーターの制御下にあるヒトA53T変異α-シヌクレイン(α-SYN)をコードするAAVトランスファープラスミド、およびpAdvDeltaF6アデノウイルスヘルパープラスミドが含まれます。
- 一過性トランスフェクションの5日後に培地を回収し、タンジェンシャルフローろ過を使用して濃縮します。
- 濃縮媒体から rAAV ベクター粒子を精製するには、iodixanol ステップグラジエントを使用します。
- ゲノムコピー(GC)測定には、リアルタイムPCRの標準的な手法を使用します。このプロトコルでは、3.0 E11 GC/mlのベクター力価を使用して、パーキンソン病(PD)のα-SYNベースのラットモデルを開発しました。
2. ラットの黒質(SN)へのrAAV α-SYNベクターの定位注入(図1)
- 通常の12時間の明暗サイクルで体重が約200〜250gの8週齢の雌Wistarラットを飼育し、ペレット状の食物と水道水に無料でアクセスできます。
- ラットをケタミン(60 mg / kg)とメデトミジン(0.4 mg / kg)の混合物を含む腹腔内(i.p.)麻酔にかけます。.ラットが麻酔され、異なる足を絞っても反応しなくなったら、マイクロトランスポンダーをラットの背中に皮下投与し、マイクロトランスポンダーインプラントを使用してさらに認識します。マイクロトランスポンダーが正しく配置され、読み取り装置で読み出せるか確認してください。
- 頭皮の上の髪を切ります。頭皮と耳の両方に局所麻酔薬を塗布します。残りの外科的処置は、無菌技術を使用して層流下で行います。
- ラットを2つのイヤーバー、口、ノーズバーを使用して定位ヘッドフレームに置きます。体温の低下を避けるために、ラットの体を紙の毛布で覆います。眼の乾燥を防ぐために眼用潤滑剤を塗布します。
- イソプロパノール70%のジョジウム1%で頭皮を消毒し、頭皮の正中線に小さな切開を行います。頭蓋骨の膜をそっとこすり落とし、生理食塩水ですすいでください。頭蓋骨を数分間乾かします。頭蓋縫合糸と2つの基準点(ブレグマとラムダ)を観察します。
- rAAVベクトルをSNに注入するには、Bregma(前後:5.3 mm、中外側:2.0 mm、背腹側:硬膜から計算した7.2 mm)に向かう座標を定義します
手記：関心領域ごとの3次元座標は、ラットの脳の脳定位アトラスを用いて計算することができ、Bregmaを解剖学的基準点として適用します。
- 10 μl のマイクロインジェクションシリンジ (30 ゲージ 20 mm) に rAAV ベクターを充填し、電動マイクロインジェクションポンプに接続された定位固定装置に入れます。一滴のベクターを放出して容量を制御し、多価洗浄洗剤pH 9(RBSなど)で除去します。
- ヘッドがヘッドフレームにまっすぐに固定されているかを目視で確認し、左右の軸を評価します。ブレグマとラムダの前後座標と中外側座標を慎重に視覚的に定義し、定位フレームの背腹側アームにある30ゲージ20mmの針を使用してそれらの高さを測定します。
- BregmaとLambdaの高低差を最大0.3mm許容します。針をBregmaに戻し、定位フレームの前後腕と中外側腕を動かして、前後座標と中外側座標を適用します。
- 注射場所で、頭蓋骨の高さを測定し、ブレグマの高さと0.3mm以上差がないことを確認します。.頭蓋骨に直径約2mmの穴を開けます。背腹側座標を適用するための基準となる硬膜の高さを測定します。または、頭蓋骨の固定厚さ(0.9 mm)を引きます。
- 26ゲージの針を使用して硬膜を貫通し、滅菌組織で血液を吸収します。すべての出血が止まるまで待ってから続行してください。
- ベクター溶液をあらかじめ装填した10μlのマイクロインジェクションシリンジを、あらかじめ決められた深さ(背腹側協調)まで脳にゆっくりと挿入します。針を所定の位置につけたまま1分間待ちます。0.25 μl/minのスループットの電動マイクロインジェクションポンプを使用して、3 μlのベクター溶液(3.0 E11ゲノムコピー/ml(中ベクター用量)または1.0 E12 GC/ml(高ベクター用量)のrAAV2/7 α-SYNまたはeGFPコントロールベクター)を注入します。
- 注射後、針をさらに5分間所定の位置に置いてから、ゆっくりと針を取り外してください。コーティングされた編組ポリエステル3.0を使用して頭皮を縫い、70%イソプロパノール中の1%ジョジウムで消毒し、定位器具から動物を穏やかに取り除きます。最初に鼻とマウスバーを緩め、次に2つの耳バーを緩めます。
- 麻酔を逆転させるには、ラットに0.5 mg / kgのアチパメゾールを腹腔内に注射し、ラットを38°Cの加熱プレート上の清潔なケージに寝かせます。体温の低下を防ぐために、ラットを紙の毛布で覆います。
- 最初の数時間は食料と水に簡単にアクセスできるようにします。最初の数日間はラットを監視します。必要に応じて、鎮痛剤.
を適用します。
手記：頭蓋骨のステッチを取り除く必要はありません。1〜2週間後、頭蓋骨は完全に修復され、刺し傷が緩みます。
