$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 均質化と分画
- ティッシュセレクション
注: 健康なコントロールからの凍結死後前頭皮質組織 (Ctl) と病理学的に確認された AD 症例が選択されました (n=2)。アミロイドプラーク分布の死後神経病理学的評価は、アルツハイマー病のレジストリを確立するコンソーシアムの半定量的スコアリング基準に従って実施されましたが、神経原線維もつれの病理はBraak病期分類システムに従って評価されました。
- 健康なコントロール(Ctl)および病理学的に確認されたAD症例から凍結死後脳組織を取得します。ドライアイス、鉗子、カミソリの刃の容器を利用して、各組織サンプルから灰白質を~250mgの部分を風袋引きされた使い捨て計量ボートで物品出しし、組織が解凍しないように注意します。均質化する各ピースの重量を記録します。
- 鉗子とカミソリを使用して、外側の灰白質と内側の白質との間の界面を目視検査することにより、灰白質を ~ 250 mg 切除します。白質を避け、さらに重要なことに、大きな血管や血まみれの領域、髄膜、またはくも膜の母体を避けてください。切断プロセス中に組織を凍結しておくには、脳組織を載せた計量ボートをドライアイスの入ったポリスチレン容器に迅速かつ頻繁に入れます。
- 分析天びんを使用して、各凍結片から切除された灰白質の正確な重量を記録します。デュースの均質化に必要な低塩(LS)バッファー(表1を参照)の容量を計算します(5 mL/gまたは20% w/v)。
- 10 mLのLSバッファーに1xプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを調製し、氷上で冷やします。
- 秤量したティッシュと秤量ボートをドライアイスから取り出し、解凍時に約2 x 2 mmの小片にさいの目に切ります。氷上の2mLの予冷済みダウンスホモジナイザーチューブに移します。
- 5 mL/g(20% w/v)の氷冷低塩(LS)緩衝液と1Xプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加します。
- 氷上の脳組織を均質化するには、高クリアランスの乳棒Aを約10ストローク、低クリアランスの乳棒Bを約15ストローク使用します。
- ガラスパスツールピペットを使用して、すべてのホモジネートを2 mLポリプロピレンチューブに移します。チューブに「TH」(Total Homogenate)、組織症例番号、およびホモジネート容量をラベル付けします。ラベル付きの1.5 mLチューブに0.8 mLを分注します。過剰なホモジネートは、同様に分注して-80°Cで保存することができます。
- 各0.8 mLアリコートに、5 M NaClおよび10%(w/v)サルコシルをそれぞれ100 μLずつ、それぞれ0.5 Mおよび1% w/vの濃度まで添加します。チューブを反転してよく混合し、氷上で15分間インキュベートします。チューブに「TH-S」(Total Homogenate-Sarkosyl)をラベル付けして、ホモジネートがサルコシルバッファー中にあることを示します(表1)。
- マイクロチッププローブを使用して、氷上で30%の振幅(最大強度= 40%)で各チューブを3つの5秒パルスで超音波処理します。
- ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法を使用してホモジネートのタンパク質濃度を決定します.
手記：組織1グラムあたり5mL LSで調製したTH-Sホモジネートの平均タンパク質濃度は15〜20 mg / mLです。ホモジネートは、すぐに分画することも、使用するまで-80°Cで保存することもできます。
- 1xプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む氷冷サーク緩衝液(表1)を使用して、TH-Sホモジネートを10 mg/mLに希釈します。
- 各TH-Sホモジネートのタンパク質5 mg(0.5 mL)を500 μLのポリカーボネート超遠心チューブに移し、サークバッファーとペアバランスします。チューブを予め冷却したローターにロードし、超遠心分離機で180,000 x gで4°Cで30分間、サルコシル可溶性上清(S1)を1.5 mLチューブに移し、-80°Cで保存します
注:(オプションの洗浄)洗剤不溶性画分(P1)を含む超遠心チューブに200μLのサークバッファーを加え、200μLのピペットチップを使用してペレット(P1)を超遠心チューブの底から取り除きます。
- 逆さにしたチューブを微量遠心機で2〜3秒(≤2,500 x g)短時間パルススピンし、ペレット(P1)とバッファーを下の1.5 mLチューブに移します。ピペッティングを上下させて不溶性ペレット(P1)をサークバッファーに再懸濁し、ペレットが破壊されるようにします。
- ペアバランスし、180,000 x gで4°Cでさらに30分間遠心分離します。
- オプションの洗浄上清(S2)を廃棄し、サルコシル不溶性ペレット(P2)を尿素緩衝液(表1)50-75μLに1x PIC(プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)を加えて室温で30分間インキュベートし、ペレットを可溶化します
手記：SDSの沈殿を避けるために、使用前に尿素緩衝液を室温まで温めてください。界面活性剤に敏感なアプリケーションでは、尿素緩衝液からSDSを省略し、不溶性ペレット(P2)を低塩緩衝液で洗浄してから尿素緩衝液に再懸濁することを検討してください。
- 再懸濁したペレット(P2)を0.5mLチューブに移し、20%の振幅(最大強度= 40%)で短時間(1秒)マイクロチップ超音波処理を使用して、ペレットを完全に可溶化します。
- サルコシル可溶性(S1)画分と不溶性(P2)画分のタンパク質濃度をBCAアッセイ法で測定します。これらの画分はすぐに使用するか、使用するまで-80°Cで保存してください。
>表 1: バッファーの一覧
| 10% w/v サルコシル溶液: ddH2O 100 ml あたり 10 g N-ラウリル - サルコシンナトリウム塩 (RT で一晩攪拌) |
| 低塩分(LS)バッファー:50 mM HEPES pH 7.0、250 mMスクロース、1 mM EDTA |
| サルコシル(サーク)緩衝液:LS緩衝液+1%(w/v)サルコシル+0.5M NaCl |
| 尿素緩衝液(-20°Cで保存):50 mM Tris-HCl pH 8.5、8M尿素、2% SDS |