実験的自己免疫性神経炎マウスモデルにおける運動機能の評価

Abstract

出典: Gonsalvez, D. G., et al., A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (2017年)。

このビデオは、百日咳毒素とミエリン模倣ペプチドおよびアジュバントを含む接種物の投与を通じてマウスモデルの運動機能障害を評価するプロセスを示しています。その後、運動機能を評価するためのトレッドミルテストを行い、免疫活性化と脱髄による神経損傷を評価します。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. EAN (実験的自己免疫性神経炎) 導入

>注:EANは、6〜8週齢の雄C57BL/6マウスで成功裏に誘導できます。導入プロトコルは合計で9日かかります。0日目は、最初の予防接種の日を指します。このプロトコルでは、注射は麻酔下で行われました(以下のステップ1.1.2を参照)。

1. -1日目:
   1. 滅菌0.1 Mマウス等張リン酸緩衝生理食塩水(MT-PBS)を使用して、1.6 μg / mLの百日咳毒素(材料の表を参照)溶液を調製します。.
   2. イソフルランによる麻酔:。
      1. マウス(C57BL/6、雄、6-8週間)を麻酔室に入れ、酸素流量を1L/minに調整します。
      2. イソフルラン気化器の電源を入れ、麻酔のために2.5%に調整し、呼吸を監視し、2分間または一次反射(角膜と後肢)が反応しなくなるまで待ちます。.
   3. マウスを麻酔チャンバーから取り出し、30_1/2 G針付きの0.5 mLシリンジを使用して腹腔内(i.p.)注射により、上記の百日咳毒素溶液250 μLを投与します。.
   4. 予防接種のための注射可能な接種物を準備します。
      1. P0180-199ペプチド(純度>98%、配列S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S)の2 mg/mL溶液を使用して溶液Aを調製します0.9%生理食塩水。
      2. フロイントの完全アジュバント(FCA、15%モノオレート+85%パラフィンオイル、乾燥死滅乾燥ブチリカム0.5 mg/mLを含む)中の結核菌20 mg/mL溶液(材料表を参照)を使用して溶液Bを調製します。
      3. 注入用の最終的な接種材料を作るには、溶液AとBの等量部分をビーズビーターで混合し、室温で1分間最高速度で混合します><。 手記： 溶液AとBはストックとして保管し、4°Cで最大1ヶ月間保存できますが、組み合わせた最終接種物はマウス注射の日に新たに調製する必要があります。
2. 0日目に、50μLの接種材料(ステップ1.1.4で概説した調製物)を、23Gの針を使用した皮下注射によりマウスに投与します><。 手記：注射は、肩甲骨の間、または尾背の後肢と尾の間に配置できます。
3. 1日目に、百日咳毒素溶液1.2μg / mL(MT-PBS中)を作成し、301/2G針付きの0.5mLシリンジを使用してi.p.注射でマウスに250μLを投与します。
4. 3日目に、上記の手順1.3を繰り返します。
   手記：ストック溶液AとBは、4°Cで最大1ヶ月間保存することができます。ただし、原液AとBを組み合わせて製造した最終的な注射用接種は、注射当日に行う必要があります。
5. 8日目に、50μLの接種物(ステップ1.1.4で概説した調製物)を、ステップ1.2と同じ注射部位(各動物)に皮下注射(上記のステップ1.2を参照)でマウスに投与
します

2. 運動機能評価

>注:運動能力は、同じ動物コホートの臨床スコアリングと並行して評価されます。運動機能評価装置は、歩行機能画像システム(資料表参照)がインストールされたコンピュータに接続する必要があります。また、評価するすべてのマウスをEAN導入前にランニングタスクに慣れさせることをお勧めします。これを行うには、疾患誘発の3日前(-3日目)に練習運転(マウスあたり2回のテストラン)を行います。

1. 運動機能評価装置の電源を入れ、ライトボタンのスイッチを入れます。
2. マウスをしっかりと握りしめ、尻尾を持ちながら赤いインクで満たされた容器にマウスを下げて足にインクを塗ります。
   手記： この手順はC57BL/6系統に必要ですが、ホワイトコート色のマウス系統を使用している場合はスキップできます。
3. マウスを歩行コンパートメントに置き、トレッドミルの速度を15cm / sに設定します。
4. トレッドミルの電源を入れ、「記録」ボタンをクリックして、歩行機能イメージングシステムを使用してマウスの走行動作をキャプチャします(材料の表を参照)。
5. タイマーを使用して、各ランニングを36秒間測定します。36秒後、記録を停止し、トレッドミルを停止します.
   手記： この 36 秒の間隔で実行中のタスクを正常に完了できなかったマウスは、失敗したと見なされます。
6. ビデオファイルを指定してフォルダに保存します。
7. 評価する各マウスについて、上記の手順を繰り返します。3日ごとに同じ実行タスクでマウスをテストします。
8. 編集した動画ファイルをソフトウェアで歩行機能パラメータ解析(資料表参照)
   手記：さまざまなモーターパラメータの分析方法の詳細はソフトウェアによって異なりますので、分析する前に製造元の指示を参照してください。研究の特定の目的に応じて、運動後機能評価のどの段階でも動物組織を採取し、免疫組織化学または電子顕微鏡法のいずれかを介して軸索およびミエリン損傷の組織学的証拠を得ることができます。

Results

>表1:EAN臨床スコアパラダイム。

...

スコア	条件	評価基準に関する注意事項とコメント
0	通常のマウス
1	活気のないOR泡立て	これは、通常の取り扱いに応じて評価され、マウスは通常、免疫後5日目から最初に活動の低下の兆候を示します
2

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6、オス、生後6-8週齢	オーストラリアンバイオリソーシズセンター、ワシントン州、オーストラリア
百日咳毒素	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA (米国カリフォルニア州)	#181
0.1M マウス等張リン酸塩緩衝生理食塩水 (MT-PBS)			ラボには独自のプロトコルがあります。
イソフルラン	Pharmachem, クイーンズランド州, オーストラリア		検査室には、投与のための独自のプロトコルがあります。
P0180–199ペプチド	無錫Nordisk Biotech Co. 中尉SHG、CHN		P0180–199、シーケンスS–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
結核菌(H37RA株)の熱死	Difco, MI, USA (米国ミシガン州)	#231141
フロイントの完全アジュバント(FCA)	Difco, MI, USA (米国ミシガン州)	#263910
16% パラホルムアルデヒド (PFA)	電子顕微鏡サービス	#15710	組織採取の日に4%PFAに希釈します。
グルタラルハイド 25%	ProSciTech Pty Ltd、クイーンズランド州、オーストラリア	#11-30*8	固定日を2.5%グルタルアルデヒドに希釈します。
アジ化ナトリウム	Chem-Supply Pty Ltd, SA, オーストラリア	SL189	0.1M MT-PBSで10%(W / v)の株式を作成します。0.03%(v / v)で使用してください。
蔗糖	Chem-Supply Pty Ltd, SA, オーストラリア	SA030	30%(w / v)で使用してください。
最適切削温度(OCT)媒体	Sakura Finetek, CA, USA (米国カリフォルニア州)	#4583
通常のロバ血清	Merck Millipore, MA, USA (米国マサチューセッツ州)	#S30-100	抗体希釈剤として、10%(v/v)または自社の研究室で測定した他の濃度で使用してください。
トリトン-X 100	シグマ・アルドリッチ、ミシガン州、米国	#90o2-31-1	0.3%(v / v)または自社の研究室で測定された他の濃度の抗体希釈液で使用してください。
ウサギ抗アミロイド前駆体タンパク質(APP)	Invitrogen (Life Technologies), カリフォルニア州, USA	S12700	1:400で使用するか、自分の研究室で滴定します。
ウサギ抗接触関連タンパク質-1(Caspr)	寄贈品:イスラエル、Wiezmann Institute of ScienceのElior Peles教授		1:500で使用するか、自研究室で滴定します。
適切なAlexa Fluor標識二次抗体	Molecular Probes (Life Technologies), オレゴン州, アメリカ	諸	1:200で使用するか、自分の研究室で滴定してください。抗体が産生された分子種の選択とAlexa Fluorの選択は、各研究室の裁量に委
水性実装液	ダコ(アジレント)、カリフォルニア州、米国	#S3023	各研究室には独自の好みがあります。
備品
0.5 mLシリンジ(301/2 g針付き	BDの	#326105
23gの針	BDの	#305143
赤いインクパッド			動物の足に印を付けるために、赤いインクパッドや赤い食用染料を使用できます。
DigiGate装置(トレッドミル付属)	eMouse Specifics Inc. マサチューセッツ州フラミンガム
DigiGateイメージングシステム	eMouse Specifics Inc. マサチューセッツ州フラミンガム
ストップウォッチ			任意のタイマーを使用できます。
DigiGait 8ソフトウェア	eMouse Specifics Inc. マサチューセッツ州フラミンガム
解剖顕微鏡	ツァイス		任意の適切な解剖顕微鏡を使用してもよい。
チャージドスライド	スーパーフロストプラス、Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
シロスタット	ライカ		任意の適切なcyrostatを使用してもよい。
灌流装置および解剖器具			ラボには独自の灌流プロトクトールがあります。
不透明な腐植チャンバー			ラボでは、不透明なプラスチック容器を使用して独自のものを作成する場合があります。
PAPペネ	GeneTex(米国)		ワックスペンシル、または表面張力を使用して、組織切片の周囲にウェルを作成することもできます。
共焦点顕微鏡	ツァイスLSM780		適切なレーザーラインを備えた任意の共焦点顕微鏡を使用できます。
フィジー/Image J	国立衛生研究所		www.fiji.sc から入手可能