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1. ショウジョウバエにおけるGal4媒介性とQF媒介性Htt導入遺伝子発現の結合
- 組織特異的なGal4またはQF「ドライバー」を含むトランスジェニックDrosophila melanogaster系統、およびGal4-UASまたはQF-QUASの下流に野生型または変異型Htt導入遺伝子を含む系統を収集および/または生成します。これらの導入遺伝子から発現するタンパク質が蛍光タンパク質に融合しているか、エピトープタグが付けられていることを確認して、同じフライで変異型と野生型Htt導入遺伝子産物を区別できるようにします。図1.
を参照してください
注:通常、ヒトHtt遺伝子のエクソン1フラグメントを使用します。しかし、トランスジェニックフライは、必要に応じて、より長いHttフラグメントまたは他の遺伝子を発現するために代わりに生成することができる。
- 変異型および野生型Htt導入遺伝子が、重複しない異なる細胞集団で発現するように遺伝的戦略を計画します。
- 発現が重複すると、同じ細胞内で合成された変異型Httタンパク質と野生型Httタンパク質が共凝集し、プリオン様イベントの検出が妨げられます。これを回避するには、Gal4 と QF 固有のリプレッサーである Gal80 と QS40 をそれぞれ使用します (図 1)。発生制御されたGal4および/またはQFドライバーを選択することで、変異型Httの分裂後細胞への発現を制限することができ、細胞分裂が細胞間凝集体の拡散に寄与する可能性を排除することができます。
- 標準的な培養条件を使用して、ハエを交配させ、「ドナー」細胞集団ではQF(またはGal4)を介して変異型Httを発現し、「レシピエント」細胞集団ではGal4(またはQF)を介して野生型Httを発現する子孫を生成します。可能な遺伝的組み合わせを示す概略図については、図1を参照してください。
手記： 図 1-4 と以前の出版物で示されたデータの生成に使用された QF ドライバーと Gal4 ドライバーには、DA1 嗅覚受容体ニューロン (ORN) ドライバー Or67d-QF と汎グリア ドライバー repo-Gal4 が含まれます。
- QF標識細胞集団とGal4標識細胞集団の両方で野生型Httを発現するコントロールフライを並行して生成します。
- 目的の遺伝子型の子孫を収集し、必要に応じて動物を老化させます。
2. 成体のショウジョウバエの脳の顕微解剖と固定
>注:この解剖手順は以前の出版物から変更されており、Htt蛍光タンパク質融合体からの直接蛍光シグナルをイメージングするための脳の準備に使用できます。
- 0.03% Triton X-100 (PBS/T) を含むリン酸緩衝生理食塩水、770 μL の PBS/T に 200 μL の 20% PFA を加えて調製した 970 μL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 固定液を含む 970 μL のマイクロ遠心チューブ、ウェルが入った透明なガラス皿、使い捨ての移送ピペット、2 つの解剖用鉗子 (1 つは No. 3 と 1 No. 5) です。
- 成虫のハエにCO2を使用して麻酔をかけ、氷上のガラス皿の1つのウェルに移します。
- トランスファーピペットを使用して、少量(~500 μL)の冷たいPBS/Tをハエを含むウェルと空のウェルに加えます。気泡を入れすぎると、解剖の妨げになる可能性があるため、避けてください。
- ガラス皿を解剖顕微鏡の下の平らな面に置き、フライ本体が視野いっぱいになり、焦点が合うまで倍率を調整します。
- ガラス皿の両側に光が当たるように、一対のグースネック光源を配置します。折りたたまれた実験組織をガラス皿の下に固定して、解剖中に体の一部/キューティクルを廃棄します。
- 利き手ではない手で3番の鉗子を使用して、PBS / Tを含むウェルに1匹のフライを移し、腹側を上にして腹部をつかんでハエを固定します。
- フライをPBS / Tに完全に浸したまま、利き手で5番の鉗子でフライヘッドを取り外します。これらの鉗子の1つの先端を、フライヘッドの片側の吻に隣接する小さなスペースのキューティクルの下に挿入します。鉗子をつまんで両側から目をつかむことにより、頭のグリップを固定します。
- 2つの鉗子を引き離して、フライヘッドを体から取り外します。フライの体は、近くに置いた実験用ティッシュに廃棄します。フライヘッドが失われないように、利き手の鉗子に圧力をかけ続けます。
- 3番の鉗子の片方の先端を、吻の反対側のキューティクルの下の同じ小さなスペースに、利き手ではない方の手に置きます。位置が決まったら、鉗子をつまんで、頭の両側の同じ位置で目をつかみます。
- キューティクルのグリップがしっかりと固定されたら、鉗子を180°でそっと引き離します。この動作により、脳に損傷を与えることなく、頭のキューティクルがバラバラになります。キューティクルの残留物を実験組織に捨てます。
- 理想的であっても、頭のキューティクルは1ステップで完全に除去できない場合があります。この場合、脳が完全に露出するまで、キューティクルを少しずつ取り除きます。鉗子に直接触れないようにして、脳を傷つけないように注意してください。
- 付着した気管をつかむか、毛細管現象によって鉗子の先端の間の空間に脳を吸引することにより、解剖した脳をPBS / Tから除去します。
手記：気管の除去は、私たちが通常イメージする脳の前面にある触角葉を覆い隠さない傾向があるため、オプションです。ただし、気管がイメージングを妨げる場合は、この操作によって脳が損傷しないように、気管を慎重に取り外してください。
- ハエの脳を、氷上の固定溶液が入った微量遠心チューブの1つに移します。脳が鉗子から離れ、固定液に沈められていることを確認します。
- すべての脳が解剖されたら、閉じたチューブを室温の暗闇で~5分間ニューテーターに置いて「ショートフィックス」にかけます
注:この短い固定ステップにより、脳が後続のステップで扱いやすくなり、微量遠心チューブの側面に付着しなくなります。
- 固定液の大部分をP1000ピペットで取り除き、廃棄します。
- この洗浄ステップとその後の洗浄ステップ中にチューブから脳を吸引しないでください。P1000を低容量(例:650μL)に設定し、2ステップで上清を取り除きます。さらに、微量遠心チューブを光源(オーバーヘッドライトなど)と一直線に保持しながら、脳をよりよく視覚化します。
- 新鮮なPBS/Tを1mL脳に加えます。暗闇で素早く洗濯(<1分)し、脳から上清を吸引して捨てます。
- 次のスケジュールに従って、室温の暗い場所でPBS / Tによる洗浄を繰り返します:クイック(< 1分)洗浄、1 X 5分、3 X 20分、および1 X 1時間の洗浄。マイクロ遠心チューブの上部を固定し、洗浄の合間にチューブをニューテーターに置きます。
- DAPI染色が必要な場合は、最後の1時間の洗浄を、PBS/Tで希釈した250 ng/mLのDAPIを30分間のインキュベーション1回で行い、その後、クイック洗浄を2回、20分×
1回の洗浄で置き換えます。
- 最後の洗浄後、脳を乱さないように注意しながら、洗浄バッファー上清の大部分を取り除き、30μLのグリセロールベースの退色防止試薬を脳に加えます。暗所で4°Cで動かさずに少なくとも1時間から最大24時間インキュベー
トします。
3. 全脳マウント
- ガラス顕微鏡スライドを解剖顕微鏡の下に置き、識別情報でラベルを付けます。
注:あるいは、脳をカバーガラスに直接取り付けて、イメージング中に脳の両側にアクセスすることもできます。この取り付け手順を説明するプロトコルは、以前に公開されている45。
- 鈍いピペットチップを使用して各微量遠心チューブから脳を取り出します(かみそりの刃を使用して1〜200μLのチップから底を~1cm取り除きます)し、スライドの中央に移します。褪色防止剤をできるだけ脳に付着させないようにします。
- 鉗子を使用して、脳を目的の方向に配置します(たとえば、背側をスライドの上部に向け、前面を上に向けて触角葉をイメージングします)。脳の向きを決めるときは、脳のイメージングに使用する顕微鏡の光路を考慮してください。
- 脳を乱すことなく、折りたたまれたラボ組織の尖った角を使用して、スライドから余分な退色防止試薬を取り除きます。スライドを暗闇で 5 ~ 10 分間放置して、脳がスライドに付着できるようにします。
- フライブレインを、ブレインの両側に4つの小さな割れたカバーガラスで囲み、~19mm×19mmの正方形を形成します。22mm×22mmのNo.1.5カバーガラスの片方の端を、これらの小さなガラス片のすぐ外側に置き、カバースリップをブレインの上にそっと下げてブリッジマウントを完成させます。
- カバーガラスや脳を乱さないように注意しながら、新しい退色防止剤をゆっくりと分注して、カバーガラスの下の表面を満たします。カバースリップに直接触れることなく、折りたたまれたラボティッシュの先のとがった角を使用して、余分な退色防止剤を拭き取ります。
- カバースリップの四隅のそれぞれに、透明で速乾性のマニキュアを一滴加えます。~10分間乾燥させます。次に、カバーガラスの4つの端をマニキュアで密封して、脳を完全に囲みます。
- 脳をすぐに画像化するか、準備ができるまで4°Cで保存します。
- Htt蛍光タンパク質融合体から内因性蛍光をイメージングする場合は、最良のシグナルを得るために24時間以内に脳をイメージングします。
>4. プリオン様の凝集体透過のイメージングと定量化
- 40Xまたは60/63Xオイル対物レンズを装備した共焦点顕微鏡を使用して、取り付けられた脳を画像化し、選択したGal4およびQFドライバーが発現する脳の領域を通じてzスライス画像を収集します(図2A、B)。
- 適切なレーザー(例:GFP/YFP/FITC の場合は 488 nm、mCherry/Cy3 の場合は 552 nm)を使用して、蛍光タンパク質融合体または免疫標識タンパク質を励起します。スペクトル検出システムまたは各蛍光色素に固有のバンド/ロングパス発光フィルターを使用して、チャネルクロストークを排除しながら最大の蛍光シグナルを捕捉する検出ウィンドウを設定します.
注:タンパク質凝集体をイメージングするときは注意してください。各集計の中央にあるピクセルは、特に大きな集計では飽和状態になりやすくなります。画像の飽和を最小限に抑えるように試みますが、より小さな凝集種からのシグナルが失われるリスクに注意してください(図2B、C、D)。彩度が高すぎると、画像の背景が増し、孤立したプンクタを特定するのが難しくなります。各データセットで最終的な画像を撮影する前に、さまざまなイメージング設定をテストして最適化します。
- 個々の p uncta を、個々の z スライス (図 2C や 図 4A など) を移動して手動で定量化するか、共焦点スライスを 3 次元 (図 3A、B) でレンダリングした後 (図 3A、B) で定量化することにより、データを分析します
手記：これは、Image Jまたはその他の画像処理ソフトウェアで行うことができます。
- 凝集体が十分に分離されており、バックグラウンド蛍光が最小限である場合は、画像解析ソフトウェアを使用して、共焦点スタックの3D再構成において、凝集体を別個の「オブジェクト」または「表面」として体系的に同定、定量化、および分析します(図3B).
手記：説明されているソフトウェアの動作は、ここで使用する機器とソフトウェアに固有のものです(資料の表を参照)。
- 共焦点 z シリーズを 3D 表示モードで視覚化します。「Analysis」ウィザードを使用して、選択したチャネル内の個々のスポットを特定します(例:図3のHttQ91-mCherry凝集体の赤色チャネル)。しきい値処理とフィルターを調整して、異種サイズのすべての集計を画像内の個々のオブジェクトとして正確に表します。
- 「Binary Processing Pre-Filter」の下の「Split objects」を有効にして、ソフトウェアアルゴリズムによって異常にマージされた密接に関連する集約を分離します。オブジェクトの総数とそれに関連する測定値は、"Measurements."
で報告されます。
手記：変異型Htt凝集体を定量するためのこの方法は、アミロイド凝集体の中心が抗体に侵入できないため、免疫染色プロトコルには適していません。その結果、凝集体は顕微鏡上でリング状の構造として現れ、画像解析ソフトウェアはこれらの個々の「スポット」を正確に識別して区別することができません。
- zスタックを手動で移動して野生型Htt骨材を定量化し、野生型Htt骨材をスコアリングすることで、複数のスライスに出現する骨材が二重スコアリングされないようにします(図4A).
手記：この手動定量アプローチは、各共焦点スタックの凝集体の数が妥当な場合(例:20-50)に使用できます。また、画像解析ソフトウェアが個々の点を同じチャネル内の周囲のシグナル(例えば、近くの細胞の拡散野生型Httからのシグナル)と区別できない場合にも役立ちます(図2B、C、図4A)。野生型Htt凝集体の定量化も、脳内の多くの正常な構造(細胞プロセスやシナプスなど)が点状に見えるため、困難な場合があります。野生型と変異型のHttシグナルの共局在化は、選択基準として使用できます。ただし、一部の変異型Htt「シード」が共焦点の検出限界を下回る可能性があります。レシピエント細胞に凝集しないHtt以外のタンパク質(GFPなど)を使用して、脳内の無関係な点状構造を標識できます。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、個々の凝集体の詳細な特性評価を行います。例えば、凝集体のサイズ分布(図3C)、変異型Httタンパク質と野生型Httタンパク質との間の共局在率(図4A)、またはFRETを使用してタンパク質間相互作用を直接測定する(図4B)ことができます。
- スポットまたは表面検出アルゴリズムを使用して、特定のチャネルで表示されるすべての凝集体を正確に識別し、個々の点のサイズ分布を決定します。画像解析ソフトウェアを使用して、スポットまたは表面の関連する測定を行います。たとえば、ステップ4.2.1.
で説明したソフトウェアの「分析」ウィザードの「測定」から「骨材の直径」(図3C)、「体積」、または「強度」の情報を取得します
手記：図3Cでは、単一のDA1糸球体で同定されたすべてのHttQ91-mCherry点の直径の分布を報告しています。
- HttQ25-YFP と HttQ91-mCherry 凝集体の間の共局在の割合は、共焦点 Z スタックをスライスごとに手動で移動して測定します (最も正確な方法)。ただし、アグリゲートを 2 回カウントしないように注意してください。これを防ぐには、フォーカス平面がアグリゲートの中心を通る場合にのみ、特定の Z スライスのアグリゲートをカウントします (図 4A)。
- アクセプター光退色法を使用して、共局在化したHttQ91-mCherryシグナルを持つ誘導HttQ25-YFP凝集体のFRET効率を計算します。
- まず、mCherryのみの信号とYFPのみの信号で信号が生成されない信号の検出ウィンドウを確立することにより、YFPチャネルとmCherryチャネル間の潜在的なクロストークを排除します。これらの設定を使用して、個々のHttQ25-YFPプンクタとそれらに関連するHttQ91-mCherry信号の「ビフォーイメージ」を撮影します(図4B)。
- 次に、赤色レーザー(552nmなど)を100%の強度に調整してmCherry信号を光退色し、信号がなくなるまでスキャンします。「変更前画像」に使用した設定に戻り、同じ点の「変更後画像」を撮影します(図4B)。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、光退色前後の各粛点の蛍光強度測定値を計算します。
- 「変更後画像」(YFPfinal)のYFPドナー蛍光から、「変更前画像」(YFPinitial)で測定されたYFPドナー蛍光を差し引いて、FRET効率を計算します。この値を YFPfinal で割り、100.
を掛けます。
手記：FRET効率は、各HttQ25-YFPアグリゲートについて、ピクセル単位または全体で計算できます(図4B)。アクセプター光退色は、各HttQ25-YFP点に関連するmCherry信号が十分に高い場合に、mCherry光退色後に検出可能なYFP消光を生成する場合にFRET効率を計算するために特に有用な手法です。
