遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

Abstract

出典: Donnelly, K. M., et al. Watching Cell-to-Cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量を示しています。脳を固定し、洗浄し、埋込前に退色防止剤で処理します。画像は共焦点顕微鏡を使用して取得され、定量化されて変異タンパク質凝集体の伝達を観察します。

Protocol

1. ショウジョウバエにおけるGal4媒介性とQF媒介性Htt導入遺伝子発現の結合

1. 組織特異的なGal4またはQF「ドライバー」を含むトランスジェニックDrosophila melanogaster系統、およびGal4-UASまたはQF-QUASの下流に野生型または変異型Htt導入遺伝子を含む系統を収集および/または生成します。これらの導入遺伝子から発現するタンパク質が蛍光タンパク質に融合しているか、エピトープタグが付けられていることを確認して、同じフライで変異型と野生型Htt導入遺伝子産物を区別できるようにします。図1.
   を参照してください 注:通常、ヒトHtt遺伝子のエクソン1フラグメントを使用します。しかし、トランスジェニックフライは、必要に応じて、より長いHttフラグメントまたは他の遺伝子を発現するために代わりに生成することができる。
2. 変異型および野生型Htt導入遺伝子が、重複しない異なる細胞集団で発現するように遺伝的戦略を計画します。
   1. 発現が重複すると、同じ細胞内で合成された変異型Httタンパク質と野生型Httタンパク質が共凝集し、プリオン様イベントの検出が妨げられます。これを回避するには、Gal4 と QF 固有のリプレッサーである Gal80 と QS40 をそれぞれ使用します (図 1)。発生制御されたGal4および/またはQFドライバ....

Results

図 1.QF-QUASおよびGal4-UASバイナリ発現系を用いた変異型および野生型Htt導入遺伝子の共役発現のための遺伝的アプローチ。「細胞A」では、病原性長polyQストレッチ(Q91)を含むmCherryタグ付き変異体Httタンパク質が、組織特異的プロモーターA(「PA」)の下流に位置するQFドライバーを用いて発現されます。「細胞B」では、正常なpolyQストレッチ(Q25)を含むYFPタグ付き野生型Httが、組織特異的プロモーターB(PB)によって制御されるGal4ドライバーを介して発現されます。図2-4では、OR67d-QFを使用してDA1 ORNでQUAS-HttQ91-mCherry発現を駆動し、repo-Gal4を使用してすべてのglia27でUAS-HttQ25-YFPを発現しました。重要なことに、HttQ91-mCherryは、導入遺伝子の上流に配置されたQUAS配列により、.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10X、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9625	1倍に希釈
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T9284-1L
キムワイプ	トーマス・サイエンティフィック	2904F24
20%パラホルムアルデヒド(PFA)	電子顕微鏡科学	15713-S
ノーマルヤギセラム(NGS)、ろ過	ランパイア生物学研究所	7332500	アリコートして受領時に凍結
チキン抗GFP	エイブスラボ	GFP-1020	1:500希釈で使用
ウサギの抗DsRed	クロンテック	632496	1:2000希釈で使用し、DsRedベースの蛍光タンパク質(mCherry、mStrawberry、tdTomatoなど)を認識できます。
マウスアンチブルッフパイロット	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	NC82	1:100希釈で使用することで、ハエの脳全体に活発なシナプス前構造がラベル付けされます
FITCアンチチキン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SA1-7200	1:250希釈で使用
Alexa Fluor 568 アンチウサギ	ライフテクノロジー	A11011 (英語)	1:250希釈で使用
Alexa Fluor 647 抗マウス抗体	ライフテクノロジー	A21235 (英語)	1:250希釈で使用
Slowfade Gold 退色防止試薬	ライフテクノロジー	S36936
顕微鏡スライド(25 x 75 x 1.0 mm)	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-143
カバーガラス(22 x 22 mm)	グローブサイエンティフィック	1404-15
デュモン生物学グレード鉗子、スタイル3	テッド・ペラ	503	利き手以外の手での使用
デュモン生物学グレードの鉗子、スタイル5	テッド・ペラ	505	利き手での使用
LAS X画像解析ソフトウェア	ライカ
Imaris画像解析ソフトウェア	ビットプレーン