反応性星膠症を誘発するためのマウスモデルにおける皮質刺し傷の発生

要約

出典:Allahyari, R. V. et al. Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、頭蓋骨の露出と脳病変の作成を含む、マウスの皮質刺し傷の手順を示しています。アストロサイトの神経保護反応である反応性アストログリオーシスを誘導し、中枢神経系の外傷、炎症、修復メカニズムを研究します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術用マウスの準備

1. マウスをホームケージから取り外し、体重を量ります(g)。
2. マウスをイソフルラン誘導チャンバーに入れ、酸素を2 L / minに、イソフルラン気化器を5に設定して、麻酔の手術面を約3〜5分導入します。マウスがつま先のピンチ反射を使用して完全に鎮静していることを確認します。
3. マウスが完全に鎮静されたら、マウスを定位固定フレームに入れ、イソフルランにチューブで取り付けられているノーズコーンに鼻を固定します。イヤーバーを外耳道に挿入して締め、頭が安定していることを確認します。
4. 耳から耳へ、そして目の間から耳の後ろまで頭を剃ります。
5. イソプロピルアルコールとベタジンヨウ素溶液を交互に3回ずつワイプして皮膚を滅菌します。
6. 手術中に両目が乾燥するのを防ぐために、両目に人工涙液を塗布します。

2. 外科手術

1. つま先や尻尾をつまんで麻酔の深さを監視します。マウスは、反応がなく、呼吸が遅く均一であるときに適切な手術面にいます。
2. 11番メスの刃を使って、目のすぐ後ろから耳の間まで、一回のしっかりとした動きで傍矢状皮膚切開を行います。皮膚を脇に動かし、右側を止血剤でクリップします。
3. No.11メスの鈍い面と綿の先端のアプリケーターを使用して、上にある膜の頭蓋骨をクリアします。必要に応じて、0.9%生理食塩水に浸した綿の先端のアプリケーターで頭蓋骨を拭きます。完全に乾かします。
4. 小さな定規を使用して、開頭術の前方境界を冠状縫合糸の尾側 1 mm に印を付け、開頭術の左端を矢状縫合糸の外側 1 mm にマーカーで印を付けます (図 1) マーカーで印を付けます。次に、開頭術の右と尾側の境界を、矢状縫合糸と冠状縫合糸からそれぞれ4mmの位置に印を付けます(図1)。
5. 0.5 mmのドリルビットを使用して、油性マーカーの輪郭に沿ってゆっくりと穴を開けて開頭術を開始します。頭蓋骨を完全に突き破らないように注意してください。No.5鉗子で孤立した頭頂骨をそっと押すと、弱い部分が圧力に取って代わられます。薄くなった骨が周囲全体で十分に弱くなったとき、骨片は除去する準備ができています。
   手記：研究者が骨を一片で取り除くのが難しい場合、これは穴あけ中に骨が十分に薄くなっていなかったことを示唆しています。骨片を簡単に取り除けるように、後続の動物で頭蓋骨をさらに穴を開けることを検討してください。
6. 23 Gの針を取り付けた10 mlのシリンジを使用して、0.9%生理食塩水を少量塗布し、分離された骨とドリル領域を浸します。
7. マニピュレーターアームを脳定位固定装置に取り付けます。新しいNo.11メスの刃を、刃の鋭い面を吻側に向けてプローブホルダーに取り付けます.
   手記：吻側組織と尾側組織は、それぞれ刃の鋭いエッジと鈍いエッジを経験しますが、貫通損傷によって引き起こされる機械的損傷は、病変の範囲で同等です。GFAP発現のアップレギュレーションや増殖など、反応性神経膠症の主要な特徴には、吻側と尾側の間で目立った違いは見られません。
8. マニピュレーターアームを邪魔にならないように、5/45角度の鉗子を使用して孤立した骨を慎重に持ち上げます。鉗子の先端を分離された骨の側面に挿入し、持ち上げ、てこの力を使用して、1回の完全な動きで残った骨片を引き抜きます。
   手記：脳を刺したり、頭蓋骨の下の硬膜を乱したりしないように注意してください。
9. 浸した吸収性ジェルフォームの小片を取り、覆われていない脳の上に置いて、乾燥を防ぎ、存在する可能性のある血液を吸収します。
10. ジェルフォームが所定の位置に配置されたら、マニピュレーターアームを所定の位置に振り、ブレードをジェルフォームの上で開頭術の中心に調整します。ジェルフォームを取り外し、硬膜に穴を開けずに先端が硬膜に触れるまでブレードを下げます。定位固定装置の垂直腕のバーニアスケールを使用して背側/腹側座標をマークします。
11. マニピュレーターのアームを使用して、ブレードを脳の3mm以内にゆっくりと下げます。これは、マニピュレーターアームのバーニアスケールマーキングを使用して実現されます。ブレードを5〜10秒間所定の位置に留まらせます。ブレードアタッチメント付きの定位固定アームを吻側から尾側に3回動かし、ブレードが開頭術の吻側と尾側の境界に到達してから反対側の端に移動します。
    手記：ブレードを挿入する前に硬膜は取り外されません。厚さが~80μm7のラット硬膜とは対照的に、マウス硬膜はかなり薄く(細胞層の厚さが数個しかない)、挿入時にメスの刃に対して目立った抵抗を生じさせません。各マウスに新しいメスの刃を使用して、各動物が一貫した怪我を受けるようにします。
12. 脳定位アームをゆっくりと持ち上げ、ブレードを脳から取り外します。ブレードを取り外した後、すぐに脳の表面に別のジェルフォームを置き、余分な血液や体液を吸収します。
13. その間に、脳定位アームを取り外し、11番メスの刃を捨てます。出血が止まったら、ジェルフォームを取り除きます。
14. エチロンやプロレンなどの非吸収性縫合糸で皮膚を縫合することにより、傷口を閉じます。縫合糸は手術後9〜10日で取り外す必要があります。
15. マウスをホームケージに戻し、マウスを加熱パッドでゆっくりと回復させ、苦痛の兆候がないか監視します。イソフルオラン誘発麻酔からの回復は、通常、イソフルオランからの除去後2〜5分以内に起こります。動物が胸骨の横臥を回復するまで、動物を放置しないでください。
16. 0.5〜1 mlの乳酸リンゲル液を皮下に投与して、水分補給を確保します。.

結果

図1:開頭術の領域を示すマウスの頭蓋骨の概略図。 青い線は、掘削する領域の境界を識別する最初のマーキングを示しています。上部と左のマークは、それぞれ冠状縫合糸または矢状縫合糸の 1 mm 下または横方向に測定されます。下部と右側のマークは、冠状縫合糸と矢状縫合糸からそれぞれ4mmで測定されます。開頭術は、マークされた境界(点線)内に円をドリルで開けることによって行われ、直径約3mmの開頭術(破線)が作成されます。概略図は縮尺になりません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステレオタックス	ハーバード大学装置	726049
高速マイクロドリル	ハーバード大学装置	724950
ステンレス製メス刃、#11	メドベット	JOR581S
5/45角度付き鉗子	ファインサイエンスツール	11251から35
ゲルフォームスポンジ 12cmx7mm	漁夫	NC9841478
抗体およびその他の試薬	生産者	カタログ番号	希釈(明視野) 希釈(蛍光)
RbアンチGFAP	だこ	Z033429-2	1:20k 1:1キロメートル競走
SHP反BrdU	アブカム	AB1893	1:2K 1:500
ビオチン化ヤギ抗ウサギ	ベクターラボラトリーズ	BA-1000	07:40
ビオチン化ウサギ抗羊	ベクターラボラトリーズ	BA-6000	07:40
Alexafluor 488ヤギ抗ウサギ	ライフテクノロジー	A-11008	07:40
Alexafluor 568ロバアンチシープ	ライフテクノロジー	A-21099	17:40
DAPI核酸染色剤	ライフテクノロジー	D3571	17:40
クレシルバイオレットアセテート	シグマ・アルドリッチ	C5042-10G	1%