リステリア菌感染後のマウス脳における細菌コロニー形成の評価

要約

出典:Ghosh, P., et al., Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、リステリア菌に感染した灌流マウスの脳からの感染性細菌負荷の定量化を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 臓器摘出と細菌負荷の測定

1. 灌流後、臓器(肝臓、脾臓など)を採取します。付着した血管系と靭帯を慎重に取り除き、臓器を5 mLの滅菌コールド(4°C)PBSを含む滅菌15 mL円錐管に別々に配置します。.さらなる処理が行われるまで、サンプルを氷上に保存します。
2. 脳を採取するには、ハサミを使用して耳の後ろの頭を切断し、動物の目の間の正中線の下の頭皮の皮膚を切ります。必要に応じて、はさみを頭蓋骨に押し付けたまま、余分な組織を切り取ります。
   1. ハサミの片方の先端を大孔(脊髄が通る頭蓋骨の基部の穴)にそっと挿入し、両側の頭蓋骨に横方向に切り込み
   を入れます。
   2. げっ歯類の目の間の頭蓋骨を正中線に沿ってそっと切り取り、横方向の圧力を加えます。脳を混乱させないようにし、脳組織とハサミとの接触を最小限に抑えてください。
   3. 細い先端の鉗子を使用して、頭蓋骨を開いて脳を露出させ、脳の下側と頭蓋骨の基部の間にヘラを置いて脳を取り除きます
      手記： これにより、脳神経線維が引き裂かれます。
   4. 5mLの滅菌冷PBSを含む15mLの円錐形チューブに脳を慎重に移します。
   5. マウスの死骸を捨て、残りの動物に対してこれらの手順を繰り返します。
      手記： すべての臓器を採取したら、処置エリアを清掃し、臓器の均質化に備えて細菌の負荷を特定します。
3. バイオセーフティキャビネットにティッシュホモジナイザーの先端を挿入し、ホモジナイザーを5%漂白剤、滅菌水、75%エタノール、滅菌水で10秒間連続して運転することにより、バイオセーフティキャビネットに配置したティッシュホモジナイザーの先端を洗浄および滅菌します。
4. 感染した脳を 15 mL の円錐管内で均質化します (設定 6、最大 rpm) に、目に見える組織片がなくなるまで。
   1. ステップ1.3で説明したようにホモジナイザーを洗浄し、細菌が次の臓器サンプルに持ち越される汚染を防ぎます。
   2. 他のすべての臓器(肝臓、脾臓など)の均質化プロセスを実行します。
   3. 均質化プロセスが完了したら、ステップ1.3で説明したようにホモジナイザーを洗浄し、さらに使用するまで保管します。
5. 臓器ホモジネートの10倍段階希釈液を滅菌PBSで調製し、希釈液をBHI寒天/ストレプトマイシンプレートにプレート化して、臓器あたりのCFUを決定します
   注:血液1mLあたりのCFUを決定するために、同様の方法が実行されます。
   1. すべての希釈液をめっきした後、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩移します。
   2. 翌日、各プレート上のコロニーの数を数えて、臓器または血液のmLあたりの細菌の総数を次のように決定します:
      CFU/臓器=(コロニー数×希釈係数)/ホモジネートめっきmL×5
      CFU/mL 血液 = (コロニー数 x 希釈係数) / めっきされた血液 mL

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブレインハートインフュージョンメディア	ベクトン・ディキンソン	237200
ストレプトマイシン硫酸塩	アムレスコ	0382から50G
ペトリ皿	VWRの	25384-342
グリセロール	VWRの	〒97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX ベーシックホモジナイザー	イカ	3352109	モデル:T18BS1
分光 光度 計	ベックマン・コールター	DU 800シリーズ
BALB/cマウス	ジャクソン研究所	モデル #000651
エチレンジアミン四酢酸	シグマ・アルドリッチ	60004
15mlコニカルチューブ	VWRの	21008-918
リン酸緩衝生理食塩水	コーニング	46から013センチメートル
ステンレス製のヘラ	VWRの	82027-520
ステンレス製はさみ(4.5インチ)	VWRの	82027-578
ステンレス鋼の細い先端鉗子(6インチ)	VWRの	82027-406