方法論記事

食餌性肥満ゼブラフィッシュにおけるオレキシンとカンナビノイド受容体の共局在の検出

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Imperatore, R., et al. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、免疫蛍光法を用いて、正常および食事誘発性肥満(DIO)の成体ゼブラフィッシュ脳組織におけるオレキシン受容体とカンナビノイド受容体の共局在を調査するためのプロトコルを示しています。

プロトコル

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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫蛍光プロトコール

  1. 組織解剖
    1. ゼブラフィッシュを氷水(氷5部/水1部、摂氏4度)に浸して生贄に捧げ、低酸素症による死を確実にするために、すべての動きが止まるまで放置します。
    2. かみそりの刃で頭を取り外します。鉗子で頭蓋骨の腹側から軟部組織を取り除きます。頭蓋骨を開き、脳の腹側から骨を取り除きます。脳の背側から皮膚と頭蓋骨を取り除きます。脳を取り除きます。
  2. 組織固定
    1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで3時間浸漬して脳を固定します。
      1. 1.755 gのNaH2PO4H2Oおよび4.575 gのNa2HPO4を450 mLの蒸留水(dH2O)に溶解して0.1 Mリン酸緩衝液(PB)を調製し、必要な量のNaOH 1NでpH 7.4に調整します。
      2. 4% PFAを0.1 M PB(pH 7.4)100 mLの0.1 M PB(pH 7.4)に溶解して4% PFAを調製します。60°Cの温度に達したら、NaOH 1Nを2〜4滴加えて透明な溶液を得ます。PFA 4%を室温(RT)で放置し、pHを制御します。pHを7.4.
        に調整します 手記： 固定時間は組織のサイズによって異なります。4〜6時間を超える組織固定は、抗原を覆い隠し、抗体-エピトープ結合を制限する過剰固定につながる可能性があります。
  3. ティッシュ埋め込み
    1. 組織を0.1 M PB(pH 7.4)で5分間ずつ3回すすぎます。
    2. 凍結保護のために、組織をPB(0.1 M、pH 7.4)中の20%スクロースに移し、4°Cで一晩保管します。次に、組織を0.1 M PB(pH 7.4)中の30%スクロースに移し、4°Cでさらに一晩保持します。
    3. 最適な切断温度(OCT)コンパウンドのブロックに組織を埋め込みます。これを行うには、液体窒素の小さなデュワーを準備し、アルミホイルを取り、それを半分に切って鍋を作ります。OCT化合物で満たされた組織を含むパンは、OCT化合物が冷却されるまで液体窒素に浸す必要があります。凍結した組織は、切片化まで-80°Cで保存できます。
  4. ティッシュカット
    1. 凍結した組織ブロックを-20°Cのクライオスタットに移し、10 μmの冠状切片または矢状切片で切断します。
    2. 免疫組織化学に適した粘着性スライドガラス上に組織を交互に連続切片で収集し、使用するまで-20°Cで保存します
      手記：-20°Cから4°Cの間のスライドは、暗いスライドボックスまたはスライドブックに保管してください。
  5. 非特異的結合部位のブロッキングと組織透過化
    1. スライド上のティッシュ領域を耐溶剤性ペンで画定します。
    2. 切片を0.1 M PB(pH 7.4)で5分間ずつ3回すすぎます。
    3. 透過化バッファーPB-Triton X-100 0.3%(PB-T)に溶解した1%正常ロバ血清で切片を室温で30分間インキュベートし、細胞膜を透過処理し、非特異的結合部位をブロックします。
      1. Triton X-100 0.3 mL を 0.1 M PB (pH 7.4) 100 mL に溶解して、Triton X-100 0.3% を調製します。
      2. 0.3% TritonX-100.
        を含むPBに1%正常ロバ血清を溶解するブロッキング溶液を調製します 手記：透過化およびブロッキングバッファーに使用される血清の動物種は、二次抗体の宿主に依存します。
  6. 一次抗体の混合物によるインキュベーション
    1. 切片を0.1 M PB(pH 7.4)で5分間ずつ3回すすぎます。
      1. 切片をRTの湿ったボックスで一晩インキュベートし、PB-Tで希釈した一次抗体の混合物を混ぜます。以下の一次抗体を使用することができます:オレキシン受容体に対するヤギ抗体(OX-2R)を1:100に希釈し、カンナビノイド受容体(CB1R)に対してウサギ抗体を1:100に希釈、またはオレキシンペプチドに対するヤギ抗体(OX-A)を1:100に希釈し、CB1Rに対して1:100に希釈したウサギ抗体
        2. 。
  7. 二次抗体の混合物によるインキュベーション
    1. 切片を0.1 M PB(pH 7.4)で5分間ずつ3回すすぎます。
    2. 切片を室温で 2 時間インキュベートし、1) ロバ抗ウサギ Alexa Fluor 488 標識二次抗体とロバ抗ヤギ Alexa Fluor 594 標識二次抗体を PB-T で 1:100 に希釈して混合します。または2)ロバ抗ヤギAlexa Fluor 488標識二次抗体とロバ抗ウサギAlexa Fluor 594標識二次抗体をPB-T.
      で1:100に希釈した混合物 手記：同じ動物宿主で開発された二次抗体を使用してください。正常な血清は、同じ種の二次抗体に属している必要があります(例:ロバで開発された二次抗体とロバの正常血清を使用してください)。一次抗体と二次抗体を界面活性剤を含むブロッキングバッファーで希釈して、細胞の透過性を高め、バックグラウンドを減らします。
  8. ティッシュの取り付け
    1. 切片を0.1 M PB(pH 7.4)で5分間ずつ3回すすぎます。
    2. 1.5 μL の DAPI (1 mg/mL) を 3 mL の PB に溶解して調製した核色素 DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で切片を対比染色します。
    3. 封入剤入りカバースリップスライド(材料表を参照)。この水性封入剤は、組織サンプルを安定させ、長期間の使用のために染色します。蛍光サンプルは、4°Cの暗所で保存できます。蛍光色素の寿命を延ばすには、退色防止剤の封入剤を使用してください。
      手記：適切な封入剤を選択してください。封入剤の最も重要なパラメータの1つは屈折率(nD)で、これはガラスの屈折率である約1.5である必要があります。ここで使用する封入剤は、特に酵素および脂質測定用に調製された試料(すなわち、上昇する一連のアルコールで脱水してはならない試料)に使用できます。
  9. コントロール
    1. セクション1.1〜1.8を繰り返し、一次抗体または二次抗体を省略するか、特定のステップで一次または二次抗血清をPBに置き換えます(ネガティブコントロール)。
    2. セクション1.1〜1.8を繰り返し、各一次抗体を過剰な相対ペプチド(ペプチド100 mg/希釈抗血清1 mL)で事前に吸収します。
    3. マウスの脳のスライスでセクション1.1〜1.8を繰り返します（ポジティブコントロール）
      手記：開始する直前に、すべてのバッファーを新たに準備します。各ステップで、セクションの周りにピペットまたはフィルターペーパーを使用して余分な液体を慎重に取り除き、セクションを常に湿度に保ちます。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンチCB1アブカムab23703
アンチOX-2RサンタクルスSC-8074
アンチOXAサンタクルスSC8070
クライオスタットライカバイオシステムCM3050S
ダピシグマ・アルドリッチ32670
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies (ロバ抗ヤギ Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodiesサーモフィッシャーA11055 (英語)
ロバ抗ヤギ Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodiesサーモフィッシャーA11058 (英語)
ロバ抗ウサギ Alexa Fluor 488-標識二次抗体サーモフィッシャーA21206の
ロバ抗ウサギ Alexa Fluor 594標識二次抗体サーモフィッシャーA21207の
エタノールアブソリュートVWRの2,08,21,330
凍結切片コンパウンドライカバイオシステムFSC 22凍結切片 のメディア
HClVWRの2,02,52,290
ImmPACT DABベクターラボSK4105
顕微鏡ライカバイオシステムDMI6000
ミクロトームライカバイオシステムRM2125RT
Na2HPO4シグマ・アルドリッチS9763
NaClシグマ・アルドリッチS7653
NaH2PO4H2Oシグマ・アルドリッチS9638
NaOHシグマ・アルドリッチS8045
ノーマルドンキーセラムシグマ・アルドリッチD9663
ノーマルラビットセラムベクターラボS-5000
Paraformaldeydeシグマ・アルドリッチP6148
トリトンX-100フルカ・アナリティカル93420
トリズマシグマ・アルドリッチT1503
VectaStain エリート ABC キットベクターラボPK6100
の の の シリーズ 型

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