In Vitro血液脳関門モデルによるFITCおよびFITC-フェリチンの浸透の研究

要約

出典:Fiandra, L., et al. In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、遊離FITCおよびFITCをロードしたフェリチンを使用して、膜インサート上の星状細胞と内皮細胞を使用して、in vitro血液脳関門(BBB)モデルの透過を研究する方法を示しています。FITCフェリチンは内皮細胞上の受容体に結合し、膜バリアを通過して下部チャンバーに移動しましたが、遊離FITCは透過が制限され、上部チャンバーに留まりました。

プロトコル

1. BBBモデルの確立

>注:血液脳関門(BBB)モデルを確立するために、市販の初代ラット脳微小血管内皮細胞(RBMEC)およびラット皮質アストロサイト(RCA)を使用することをお勧めします。すべてのステップは、無菌試薬と使い捨て品を層流フードで取り扱って実行する必要があります。

1. 細胞培養
   1. ポリ-L-リジン100 μg/ml(室温で1時間、室温)またはフィブロネクチン50 μg/ml(37°Cで1時間)を細胞培養フラスコに塗布して、それぞれRCAまたはRBMECの付着を促進します。次に、1 x 10⁶ RCAおよび5 x 10⁵ RBMECを内皮細胞培地で解凍し、5%ウシ胎児血清、1%内皮細胞増殖サプリメント、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(sECM)を補充します。T175フラスコにRCAを20 mL sECMに、RBMECをT75フラスコに10 mL sECMに播種します
      注:RCAおよびRBMECの解凍および播種継ぎは、BBBモデルで試験する実験条件の数に応じて、細胞密度および培養時間の観点から調整する必要があります。1 x 10⁶ RCAの1バイアルと5 x 10⁵ RBMECの1バイアルから始めることで、最大20個のBBBベアリングインサートを得ることができます。
   2. 細胞を加湿雰囲気中で約6日間、37°Cおよび5%CO₂に維持し、RCAが約80%、RBMECが90%を超えるコンフルエンスになるまで維持します。トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)溶液(トリプシン1:250)を使用して5分間(T75フラスコには1 mlトリプシン、T175フラスコには2 ml)細胞を剥離します。sECM(2:1)でトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を750 × gで5分間遠心分離し、ペレットを60 mLのsECMに再懸濁します。
   3. RBMECを3つのT175フラスコに分割し、sECMでさらに3日間培養してから、インサートに播種します。Burkerチャンバー内の光学顕微鏡でトリパンブルーで1:1に希釈した細胞懸濁液を観察して、生きているRCAの総数を数えます。
2. インサートへの細胞播種
   1. 6つのマルチウェル透明インサートのポリエチレンテレフタレート(PET)膜の片側をポリ-L-リジン100μg/mLで処理し、もう片側をフィブロネクチン50μg/mLで処理して、RCAおよびBMECの接着を可能にします。PETメンブレンとの接触を避けるために、インサートをピンセットで取り扱ってください。
      1. インサートを6ウェルプレートに入れ、フィブロネクチン溶液(最小500μl)を上部チャンバーに加えます。37°Cで1時間のインキュベーション後、フィブロネクチン溶液を取り出し、インサートをマルチウェルプレートから取り出し、150 cm²のシャーレの底に逆さまに置きます。
      2. インサートの底面に800 μlのポリ-L-リジンを静かに加え(図1Aを参照)、溶液をインサートに室温で1時間保持します。
      3. 溶液を吸引し、インサートをRTで15〜30分間乾燥させます。これで、インサートは細胞播種の準備が整いましたが、BBB構造に進む前に、マルチウェルプレートに4°Cで数日間保存することもできます
         注:FD40フラックス測定によるBBBの確立を検証するためのコントロールとして使用するために、少なくとも3つのコーティングインサートをセルから離しておくことを忘れないでください。
   2. 800 μlの細胞懸濁液を逆さまのインサートに滴下することにより、ポリ-L-リジンコーティングインサートの底面にRCA(35,000 / cm²)を播種します(図1A)。RCA懸濁液をインサートに4時間RTで放置し、細胞をメンブレンに効率的に付着させます。
   3. 残留溶液を吸引し、インサートを2 mlのsECMを含むウェルに入れ、マルチウェルプレートを加湿雰囲気で37°Cおよび5%CO₂に維持し、2日ごとにsECMを交換します。
   4. 3日後、RCAがインサートの下面をコーティングしたら、次の手順に従ってRBMECをインサートの上面に播種します。
      1. T175フラスコからRBMECを取り外し、ステップ1.1.2および1.1.3で報告されているように、全生細胞をカウントします。
      2. RBMECs(60,000/cm²)をsECM(1,000 μl)のインサートの上面に播種し(図1B)、アストロサイトのみのインサートを3つ残して、経内皮電気抵抗(TEER)バックグラウンドとして使用します。マルチウェルプレートを標準的な培養条件に置きます。システムを少なくとも3日間培養し、2日ごとに内側と下部のチャンバーのsECMを交換します。

2. BBBの検証

1. TEER測定
   1. 共培養の3^日目に、BBBベアリングインサートを適切なチャンバー(キャップ付きで、チャンバーとキャップの両方に電圧検出電極と電流電極のペアが含まれている)に挿入し、4 mlのsECMで満たされてTEERを確認します。上皮組織ボルト/オーム計に接続します。
   2. セルBBBシステムのTEER測定値とともに、RCAを持つ3つのインサートのTEER値を記録し、BBBで得られた値から減算します。結果のTEER値にインサートの表面(4.2 cm²)を掛けて、結果をΩ x cm²として表します。
   3. 共培養の3日目から、毎日TEERを測定します。手記：TEERが増加する最初の期間の後、記録された値は少なくとも連続して2日間(通常は共培養の5^日目から7^日目の間)安定しているはずです。その時点で、BBBは検証の2番目のステップ(セクション2.2)および/またはトランスBBB実験の準備ができています
      注:セクション2.1で説明した手順は、以下の透過性実験(セクション3)と同じBBBシステムで実行できます。無菌条件下で操作してください。

>3. FITCを装填したフェリチン(FnN)のトランスBBB透過

>注:ヒトフェリチン(Fn)の組換え変異体で、大腸菌で生産され、ナノケージ(FnN)で組み立てられます。FnNにはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が充填されており、Fnと充填された分子の両方の濃度が正確に測定されます。

1. FITCおよびFITC-FnNのTrans-BBBフラックス
   1. 検証済みのBBBモデルの上部チャンバーから下部チャンバーへのFITC-FnNフラックス(通常は共培養の5^日目から7日目)を、インキュベーションの7時間後および24時間後の遊離色素のフラックスと比較して、次の手順で測定します。
      1. FITC-FnN(50 μg/ml FnN、1.1 μM FITC)または等量の遊離FITCを、各製剤について少なくとも6つのBBBシステムの上部チャンバーに加え、7時間後に少なくとも3つのインサートの下部チャンバーから2 mlのsECM溶液を引き出し、24時間後に他の3つのインサートの下部チャンバーから2 mlのsECM溶液を回収します。
      2. 分光蛍光光度計(λ_ex 488 nm、λ_em 515 nm、スリット5)で採取したサンプル500 μlの蛍光強度を測定します。
      3. sECMバックグラウンド蛍光を得るには、同じ分析パラメーターを使用して500 μlの培地を測定します。すべてのFITCまたはFITC-FnN蛍光値からsECMバックグラウンド蛍光を差し引きます。
      4. 得られた蛍光値を、500 μl sECMに溶解した遊離色素またはナノ配合色素の既知の濃度(6.87、13.75、27.5、55 nM)で得られた2つの異なる検量線と比較することにより、透過FITCまたはFITC-FnNの濃度を決定します。

結果

図1:インサートへの細胞播種。 RCA(A)およびRBMEC(B)は、マルチウェルプレートインサートの反対側の2つの側面への播種手順。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ラット脳微小血管内皮細胞	イノプロト	P10308	Sprague Dawleyラット脳組織から単離され、Passage 1で凍結保存され、凍結配送
皮質アストロサイト	イノプロト	P10202	2日間のラット脳組織から単離され、継代1で凍結保存され、凍結して配送されました。
内皮細胞培地キット	イノプロト	P60104	ECM (500 ml) と胎児ボビン血清 (25 ml)、内皮細胞増殖サプリメント (5 ml) とペニシリン/ストレプトマイシン (5 ml)。使用前に37°Cの水浴で温め、光から保護
トリプシン-EDTAフェノールレッドなし	ユーロクローン	ECM0920D	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン40000	シグマ	FD40Sの	光から保護する
ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水(CaおよびMgなし	ユーロクローン	ECB4004L
トリトンX-100	シグマ	T8787
ウシ血清アルブミン	シグマ	A7906
ヤギ血清	ユーロクローン	ECS0200D
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩	シグマ	P1274	同じソリューションを複数回使用できます
ウシ血漿由来のフィブロネクチン	シグマ	F1141	同じソリューションを複数回使用できます
ポリエチレンテレフタレート(PET)インサート	隼	F3090	透明ポリエチレンテレフタレート(PET)膜、表面積:4.2cm2、細孔径:0.4μm/表面積
T75 プリモTCフラスコ	ユーロクローン	ET7076
T175 プリモTCフラスコ	ユーロクローン	ET7181
EVOM2 上皮組織電圧/オーム計	世界の精密機器 ドイツ	エボム2
エンドーム - 24SNAPカップ	世界の精密機器 ドイツ	エンドーム-24スナップ
カメラ付き光・蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	DM IL LED Fluo / ICC50 Wカメラモジュール	カメラ付き生細胞の倒立顕微鏡
共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	TCSのSPE

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