ラット脳の異なる細胞内コンパートメントにおけるプロテアソーム活性の測定

1. プロテアソーム活性アッセイ

>注:プロテアソーム活性は、20S Proteasome Activity Kitのわずかに変更されたバージョンを使用して、均質化された脳組織で測定できます。このアッセイは、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定するものではありません。むしろ、20Sコアの活性を測定するため、26Sプロテアソーム複合体全体ではなく、コア自体の活性を理解するための代理としてのみ機能します。このアッセイの成功は、凍結融解サイクルの繰り返しや界面活性剤(特にイオン性)のレベルの増加により低下し、360/460(励起/発光)フィルターセットと最大37°Cの加熱機能を備えたプレートリーダーを使用する必要があります。

1. プレートリーダーの設定:37°Cに予温し、ランを通して保持します。​
   1. 励起を 360 に、放出を 460 に設定します。使用している96ウェルプレートが透明な場合は、光学系の位置を[Bottom]に設定します。ダーク/ブラックの96ウェルプレートを使用する場合は、光学部品の位置を「上」に設定します。
   2. 古いプレートリーダーモデルは、蛍光読み取りオプションで自動ゲインに設定します。新しいモデルはこれに事前設定されています。2時間の時間でキネティックランをプログラムし、30分ごとにスキャン(読み取り)します。
2. キットに含まれている10xアッセイバッファーを13.5 mLの超純水で再構成します。14 μL の 100 mM ATP を now 1x バッファーに加えます。これにより、サンプル中のプロテアソーム活性が大幅に向上し、アッセイの信頼性が向上します。最終的な20S Assayバッファーは、必要になるまで氷上または4°Cで保存でき、数ヶ月間安定です。
3. キットに付属のAMC標準を100μLのDMSOで再構成します。この手順は、標準が光に敏感であるため、暗闇または暗い場所で実行します。
4. 再構成された標準を使用して、暗所または暗い条件下でAMCの標準曲線を作成します。
   1. 別々の0.5 mL微量遠心チューブに、AMC標準試料の16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、および0 μL(AMC濃度20、10、8、4、2、1、0.5、および0 μM相当)を加えます。
   2. これらのチューブに、84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6、100μLの20S Assayバッファーを同じ順序で加えます。これにより、一連の高濃度から低濃度のAMCが生成され、プレートリーダーのキャリブレーションと均質化されたサンプル中のプロテアソーム活性の分析に使用されます。
   3. 希釈した標準試料はすべて、必要になるまで氷上暗所で保管してください。
5. キットに付属のプロテアソーム基質(Suc-LLVY-AMC)を65μLのDMSOで再構成します。このステップは、基材が光に敏感であるため、暗い場所または暗い条件下で実行します。20S Assayバッファーを使用して、新しい1.5 mL微量遠心チューブでプロテアソーム基質を1:20に希釈します。希釈した基質を、必要になるまで氷上で暗所で保存します。
   手記：例えば、プレートに10個のサンプルと1個のブランクがある場合、ウェルあたり10μLで22ウェル(重複あり)に十分な希釈基質が必要になります。これは、ピペッティングエラーに必要な量が220 μL + 30 μLに相当し、12.5 μLの基質と237.5 μLの20S Assayバッファーが必要です。
6. 必要なサンプルを解凍し(凍結している場合)、正規化した量を96ウェルプレートに加えます。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の調製によって異なります。一般に、10〜20μgは任意の細胞内画分に十分です。
7. サンプルウェルの容量を超純水で80μLにします。添加量は、添加するサンプルの量によって異なります。例えば、サンプル1が4.5μL、サンプル2が8.7μLの場合、必要な水の量はそれぞれ75.5μLと71.3μLとなります。2つの別々のウェルに、80 μLの水のみを加えます。これらはアッセイブランクになります.
   手記：ピペッティングエラーによるタンパク質量の変化を制限するために、タンパク質濃度を最も低濃度のサンプルに正規化することができます。これにより、すべての条件で同じサンプル量を使用できるようになります。
8. 10 μLの20S Assayバッファーを、アッセイブランクを含む各ウェルに加えます。ここでは、ウェル間で一貫したアッセイ量を確保するために、リピーター/自動ピペットをお勧めします。
9. 任意の選択:この段階で、必要に応じてin vitro操作を導入します;これには、ビヒクルを含む各サンプルが処理ごとに追加の2ウェルを有することが必要になります。その場合は、5〜10 μLの目的の薬物/化合物を2つのサンプルウェルに追加し、同量のコントロール/ビヒクルを別の2つのウェルに追加します。プレートを予熱したプレートリーダーまたは37°Cのインキュベーターに30分間置きます。
10. 電気を消すか、暗い部屋に入ってください。希釈したAMC標準物質100μLをすべて新しいウェルに加えます。各標準には 1 つのウェルがあります。
11. 暗所では、希釈したプロテアソーム基質10 μLをサンプルおよびアッセイブランクを含むウェルに加えますが、AMC標準試料には加えません。ここでは、ウェル間で一貫したアッセイ量を確保するために、リピーター/自動ピペットをお勧めします。
12. プレートをプレートリーダーにセットし、キネティックランを開始します。
    手記：プレートは、キネティックラン中に常に攪拌されている必要はありませんが、ユーザーは必要に応じて選択することができます
13. キネティックランの最後に、生の360/460蛍光値をMicrosoft Excelにエクスポートします。
    1. 各標準、各サンプル、および5つのスキャンすべてについてAssay Blankの重複ウェルを一緒に平均化します。生の蛍光値は、サンプルのスキャン全体で増加しますが、標準試料およびアッセイブランクでは安定している(またはわずかに減少している)必要があります。
    2. 最高AMC標準ウェルの平均を取り、既知の濃度(20 μM)で割ります。この値をアッセイで使用されるサンプル濃度で割ると、標準化されたAMC値が得られます。各サンプルとアッセイブランク平均について、標準化されたAMC値で除算します。
    3. この最終値をアッセイで使用したサンプル濃度で割ると、各サンプルとアッセイブランクの正規化値が得られます。これを 5 つのスキャンすべてで行います。
    4. 5つのスキャンすべてについて、正規化された各サンプル値から正規化されたアッセイブランク値を差し引きます。