インパクターデバイスを用いた外傷性脳損傷のマウスモデルの生成

要約

出典:Schwulst, S. J. et al.外傷性脳損傷の誘発のための制御された皮質衝撃のマウスモデル。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、マウスモデルで外傷性脳損傷(TBI)を誘発する手順を示しています。頭蓋骨が露出した麻酔マウスを採取して頭蓋骨に開口部を作り、その後、衝撃装置を使用して制御された皮質損傷を誘発します。損傷は脳組織に損傷を与え、認知機能や運動協調性に障害を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 麻酔を誘発します

1. ケタミン (125 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) を腹腔内に注射してマウスに麻酔をかけます。

2. 15分ごとのバイタルサインモニタリング

1. 体温、呼吸数、肌の色を監視します。マウスは手触りが温かみを感じるはずです。肌はピンク色で、よく灌流されているはずです。呼吸数は毎分50〜70回の範囲で行う必要があります。

3. 術前処置

1. 傷害誘発の前日にすべてのマウスの体重を量ります。
2. 実験対象ごとにオートクレーブ滅菌して、手術器具1セットを滅菌します。使用前に衝撃を与えるデバイスを滅菌してください。
3. 「低」設定に設定された電気加熱パッドの上に清潔なケージを置き、マウスが歩行後に熱から離れることができるように配置して、回復ケージを準備します。
4. 滅菌された層流フード内に手術室を設置します。
   1. 脳定位固定装置用操作フレームを配置します。
   2. インパクトデバイスを脳定位固定装置フレームに取り付けます。
   3. 速度と滞留時間に必要な生体力学的パラメータで作動装置を設定します.
      手記：このプロトコルでは、重度の脳損傷が、直径 3 mm の衝撃先端を使用して、直径 5 mm の頭蓋切除術を使用し、速度を 2.5 m/s に設定し、滞留時間を 0.1 秒にすることで説明します。広範囲の生体力学的パラメータを使用して、TBIの全スペクトルを誘導できます。
5. 新しい個人用保護具と滅菌手袋を着用してください。
6. 電動バリカンを使用して手術部位から毛皮を剃ります。
7. マウスの目に保護軟膏を塗布して、角膜の損傷や乾燥を防ぎます。.
8. マウスを手術室に置きます。
9. ヨウ素ベースの外科用スクラブとアルコールを3回交互に使用して皮膚を準備します。

4. 制御された皮質衝撃の適用

1. 頭蓋骨を露出させるメスで頭皮を正中線の1cmに切開します。
2. 両側の側頭骨をミニチュアのイヤーバーで固定し、切歯を切歯クランプ内に固定することで、マウスを定位固定装置の操作フレーム内に配置して、マウスの頭部を安定して3点保持します。
3. 止血鉗子またはロック鉗子を使用して頭皮を手術部位から引き離し、頭蓋切除術中に頭皮がドリルビットに接触しないようにします。
4. 露出した頭蓋骨の矢状縫合糸と冠状縫合糸を特定します.
   手記：このプロトコルは、矢状縫合糸の左 2 mm と冠状縫合糸の 2 mm の吻側の中心に頭蓋切除術を集中させます。
5. トレフィンドリルビット付きのドリルを使用して頭蓋切除術を行います。
   1. 頭蓋切除術を行うには、まずドリルを最大速度で作動させ、次に頭蓋骨切除部位の頭蓋骨に垂直にトレフィンドリルビットを適用します。
   2. 頭蓋骨に接触したら、ドリルに穏やかで均等な圧力をかけます。ドリルが頭蓋骨を貫通すると、わずかな「ギブ」が感じられます。下にある硬膜を貫通しないでください.
      手記：このプロトコルでは、5mmのトレフィンドリルビットを使用して頭蓋切除術を行います。
6. 鉗子と小さなゲージの皮下注射針を使用して骨弁を切除し、下にある硬膜を完全に露出させます。
7. インパクターの先端を手術野に回転させ、露出した硬膜に接触するまで下げます。接触が行われると、機器の接触センサーが可聴音を鳴らし、接触が行われたことを外科医に警告します。これにより、変形深度が設定されるゼロポイントがマークされます。
   手記：このプロトコルは、3mmの衝撃チップを使用して重傷を負わせます。1 mmほどの小さな先端を使用して、より局所的な損傷を適用することができます。
8. インパクトチップを引っ込め、定位固定装置フレームのインパクター位置を下げて、希望のインパクト深度を設定します。
   手記：このプロトコルでは、変形の深さを2mmに設定することにより、重傷を負うことを説明します。
9. 作動装置のインパクターを作動させて傷害を適用します。
10. インパクトデバイスをフィールドから回転させ、動物を脳定位固定装置フレームから取り外します。

5. 手術部位の閉鎖

1. 頭蓋骨と負傷した皮質表面からの出血を、滅菌綿の先端アプリケーターから直接圧力をかけて制御します。
2. 滅菌綿の先端のアプリケーターで頭蓋骨を乾かします。
3. 市販の外科用接着剤またはモノフィラメント縫合糸を使用して、頭蓋切除術の頭皮を閉じます.
   手記：このプロトコルでは、獣医用外科用接着剤を使用して頭皮を閉じます。骨フラップは交換されず、廃棄されます。

6. 術後のケアとモニタリング

1. 術後鎮痛を投与します (例: 徐放性ブプレノルフィン 0.1 〜 0.5 mg/kg を皮下投与し、72 時間の持続鎮痛を提供します)。
2. 動物を清潔な温めたケージの側方褥瘡回復位置に置きます。
3. 目が覚めて動くまで動物を観察し、その後、各マウスを自宅のケージに戻します。
4. 食料と水への自由なアクセスを確保します。通常の食物と水の摂取は、通常、怪我をしてから1〜2時間以内に再開します。
5. 実験中は3日ごとに体重を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AnaSed インジェクション キシラジン滅菌溶液	株式会社ロイド	5939911020
ブプレノルフィンSRラボ0.5mg / mL	ズーファーム-ワイルドライフファーマシューティカルズUSA	BSRLAB0.5-182012
高速ロータリーマイクロモーターKiT0	フォアダムエレクトリックカンパニー	K.1070
Stereotaxix CCIのImapact one	ライカバイオシステムズNussloch GmbH	39463920
ケタテシアケタミンHCl注射USP	ヘンリー・シャイン社	56344
マウス専用脳定位固定装置	ライカバイオシステムズNussloch GmbH	39462980
マイクロドリル用トレフィン	ファインサイエンスツールズ株式会社	18004-50