虚血性マウス脳組織からの細胞懸濁液の取得

要約

出典:Pösel, C., et al.虚血性マウス脳からの免疫細胞の分離とフローサイトメトリー解析。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、脳卒中研究における炎症応答を研究するために、脳細胞と浸潤性マウスの脳組織から脳細胞と浸潤免疫細胞を酵素消化によって分離し、続いて密度勾配遠心分離によって細胞残骸とミエリンを除去する手順を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査によってレビューされ、承認されています。

1. 試薬の調製

1. 消化緩衝液(半球あたり1 mL):精製された消化酵素の標準化された混合物、例えば、低熱分解濃度(TL)のリベラーゼを、カルシウム(Ca)とマグネシウム(Mg)を含むHanks Balanced Salt Solution(HBSS)に2U/mlの濃度に溶解します。
2. DNAseによる緩衝液の洗浄:DNAse Iを、子牛胎児血清(FCS)の10%を含むHBSS(Ca/Mg(カルシウム/マグネシウム)フリー)に666U/mlの濃度に溶解します。
3. DNAseを含まない洗浄バッファー:FCSを10%含有するHBSS(Ca/Mgフリー)。
4. 密度勾配培地(半球あたり5 mL):9部の密度勾配培地と1.5 M塩化ナトリウム1部を混合することにより、ストックの等張密度勾配培地(SIP;100%)を調製します。FCSを3%含むHBSS(Ca/Mgフリー)を適量添加し、SIPを25%密度に希釈します。

2. 脳組織の単一細胞懸濁液への解離

1. きれいなカミソリの刃で脳幹と小脳を慎重に取り除きます。清潔なカミソリの刃を使用して脳を半角化し、冠状面に沿って各半球をほぼ同じサイズの3つに切断します。
2. 5 mLシリンジのプランジャーエンドを使用して、100 μmセルストレーナーを介して各半球の組織をミンチで解剖しました。セルストレーナーを氷冷HBSS(+Ca/Mg)で連続的にすすぎます。均質化されたサンプルを氷上に保存します。
3. 286 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。ペレットを1 mLの消化バッファーに再懸濁し、懸濁液を2 mLのチューブに移します。懸濁液を37°Cの低速連続回転下で1時間インキュベートします。
4. 70 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をふるいにかけ、DNAseを含む3 mLの洗浄バッファーで十分にすすぎ、続いて15 mLのDNAseフリー洗浄バッファーで洗浄します。286 x g、18°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。手記：DNAseを使用すると、細胞の凝集につながり、細胞の生存を損なう可能性のある細胞溶解によって引き起こされるDNA粘液が排除されます。

3. ミエリンと細胞破片の除去のための密度勾配遠心分離

1. 細胞ペレットを5 mLの25%密度グラジエント培地に再懸濁し、懸濁液を15 mLチューブにピペットで移します。ピペッティングを繰り返して穏やかに繰り返し、泡の形成を避けて十分に混合します。手記：密度勾配培地は、細胞凝集を防ぐためにRTで使用する必要があります。
2. 521 x g、18°Cで20分間遠心分離し、ローターの最も低い加速度プロファイルを使用し、ローターをブレーキなしで停止させます。チューブを振らずに遠心分離機からそっと取り外します。ミエリンコートと上清を慎重に吸引し、チューブの底にある細胞ペレットを保存します。手記：ミエリンコート全体が取り除かれると、フローサイトメトリー解析が損なわれますので、必ず取り外してください。
3. ペレットを10 mLのDNAseフリー洗浄バッファーに再懸濁し、懸濁液を新しい15 mLチューブにピペットで移します。手記： 密度勾配培地の十分な除去が最終細胞サンプルの量と品質に大きく寄与するため、この洗浄ステップは非常に重要です。
4. 再度286 x g、10°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を100 μLの冷洗浄バッファーに再懸濁し、血球計算盤でトリパンブルー排除法により細胞数と生存率を測定します。サンプルは4°Cで保存し、さらに迅速に処理します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MACSmixチューブローテーター	ミルテニーバイオテックGmbH
ヘレウスマルチフュージ 3SR+	サーモサイエンティフィック
ハンクの緩衝塩溶液(HBSS)	ギブコ/ライフテクノロジーズ社	14175から129
HBSSとカルシウム/マグネシウム	ギブコ/ライフテクノロジーズ社	24020-091
リベラーゼTL	ロシュ・ダイアグノスティックス社	5401020001	室温で使用
パーコールプラス	GEヘルスケアヨーロッパGmbH	17-5445-01
ウシ胎児血清	パンバイオテクノロジー	3302-P101003
トリパンブルー	ギブコ/ライフテクノロジーズ社	15250-061
トゥルーカウント	BDバイオサイエンス	340334
リン酸緩衝生理食塩水	バイオクロムAG	L 182-10
DNase I	ロシュ・ダイアグノスティックス社	11284932001
シリコンチューブ、1m	世界の精密機器	503022
ファインアイリスハサミシャープ/ブラント	ファインサイエンスツール	14028から10
ストレート1x2歯鉗子	ファインサイエンスツール	11021-14
鈍端鉗子	ファインサイエンスツール	11008-13
5mlシリンジプランジャー	Carl Roth GmbH (ブラウン)	EP96.1
セルストレーナー、100μm	I.シューベルト博士、BD	2360-00
オムニカンファインドーズシリンジ 1ML	ブラウン	未定
セルストレーナー、70μm	グライナー・バイオワン社	542070
血清ピペット、10ml	グライナー・バイオワン社	607180
血清ピペット、10ml	ザルスタットAG&Co	86,12,54,025
血清ピペット、25ml	グライナー・バイオワン社	760180
血清ピペット、5ml	グライナー・バイオワン社	606180
血清ピペット、25ml	ザルスタットAG&Co	86,16,85,020
血清ピペット、5ml	ザルスタットAG&Co	86,12,53,025
ヒント、0,1-10μl	コーニング B.V.Life サイエンス	4840
ヒント、100-1000μl	グライナー・バイオワン社	740290
ヒント、10-200μl	グライナー・バイオワン社	739296
反応チューブ1,5ml	グライナー・バイオワン社	616201
反応チューブ 2ml	グライナー・バイオワン社	623201
細菌学的なペトリ皿、94x16mm	グライナー・バイオワン社	633180
ファルコン 15ml	グライナー・バイオワン社	188271
ファルコン 50ml	VWRインターナショナルGmbH(BD)	〒734-0448
ノイバウアー血球計算盤	バイオクロムAG	PDHC-N01
カミソリの刃	カール・ロスGmbH	CK07.1