パーキンソン病のラットモデルにおけるレボドパ誘発性ジスキネジアの誘導

要約

出典: Caulfield, M. E., et al. Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオは、パーキンソン病ラットモデルでレボドパ誘発性ジスキネジアを誘導するプロセスを示しています。これは、レボドパをドーパミン変換阻害剤と一緒に投与するものです。注射を繰り返すと、脳のニューロンが過剰に刺激され、運動機能障害を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 試薬と消耗品の準備

1. L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル塩酸塩(レボドパまたはL-DOPA)と、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤である塩酸ベンセラジド(材料の表を参照)の用量、評価頻度、および調査課題に適した実験タイムラインを決定します(図1).
   手記： 特定の治療法が既存のL-DOPA誘発性ジスキネジア(LID)を減少させる可能性があるかどうかを尋ねることから、LID導入を予防することまで、さまざまな答えを求めるために調査上の質問を提起することができます。また、治療効果がレボドパの用量に依存するかどうか、またはLIDの発現および/または治療効果が被験者の性別、種、年齢によって異なるかどうかを調べることもできます。
2. ラットの体重を毎週測定し、研究中の継続的な体重変化に基づいて適切な薬物量を計算します。
   手記： LID+ラットの活動性が亢進しているため、長期のL-DOPA治療により体重減少の可能性があります。体重減少が発生した場合は、L-DOPA注射後にラットに栄養的に完全で非常に口当たりの良いおやつを提供します(材料の表を参照)。
3. 各週の濃度に必要なL-DOPAとベンセラジドの量を計算し、注射の各日の凍結乾燥アリコートを秤量し、治療日までガラスの琥珀色のバイアルに-20°Cで1〜2週間組み合わせて保存します><。 手記： 目標用量は12mg/kgまたはL-DOPA/体重1000gです。補足情報では、ラット体重1cc/kgの注射量で12mgのL-DOPA/kg体重を使用して、1週間の各日に必要なL-DOPAと生理食塩水の量を決定するための計算例を示します。

2. 部屋とケージのセットアップ

1. 6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)病変手術後3〜4週間後のL-DOPA治療の初日に、ラットをIACUC承認の濃縮を含む単一のハウジングに移します。
2. 行動評価に対する仲間の干渉を避けるために、研究全体を通して単一のハウジングに維持します。
3. LID定格の日には、ホームケージをスチールワイヤーラックに置き、ラットを最適に見ることができるように約45°の角度で回します(図2A)。識別を裏返します tag (図2B)を上向きにし、ケージ内のウォーターボトル、フードラック、およびあらゆる種類の濃縮物(図2C)を取り外して、行動評価の妨害を避けます。

3. レボドパ注射とジスキネジアの評価

1. L-DOPAの皮下注射
   1. L-DOPAを毎日注射する直前に、琥珀色のバイアルで事前に秤量した凍結乾燥L-DOPAとベンセラジドの混合物に適切な量の滅菌生理食塩水を加え、10秒間よく振とうします(ステップ1.3).
      注:目標注射量は1 mL / 1000 g体重です(1 mLあたり12 mg L-DOPAを使用)。滅菌生理食塩水の量は、研究ごとの動物の数によって異なります。
   2. 個々のシリンジ(例:1.0または0.5mL、26G針付き)に各動物に必要な容量(1 mL/kgラット体重)を充填し、各シリンジに個々の動物識別のラベルを付けます
      手記： 充填されたシリンジは、注射時まで滅菌ポーチで光から保護してください。.L-DOPAは、水性環境下で酸素と光の存在下で急速に酸化します。
   3. 最初のケージを注入ベンチに持っていきます。
   4. ラットをケージから取り出し、注射面に置きます。
   5. ラットが休んでいる表面に対して頭と肩を、利き手ではない手のひらでそっと拘束します。
   6. 肩甲骨を覆う背中の皮膚を、利き手ではない手の親指と人差し指でやさしく首筋にします。次に、筋肉内注射を避けるために針をできるだけ体と平行に保ちながら、利き手でL-DOPAボリュームを指の間/下の皮下腔に注入します
      手記： ラットは注射前に麻酔をかけられません。
   7. 使用済みの個々の注射器は、鋭利な容器に廃棄してください。
   8. ラットを個々のケージに入れ、LID評価日を除いて栄養的に完全なおやつを追加して、評価が完了するまで行動評価に干渉しないようにします。
   9. 必要な評価時間と評価日の試験中のラットの数に応じて、タイマーを1〜2分に設定します。次のケージを取り出し、タイマーが表示されたら次のラットを注入します。
   10. これを繰り返し、1〜2分ごとに1匹のラットを注射し、すべてのラットが注射されるまで注射します。
2. 注射後のレボドパ誘発性ジスキネジアの評価
   1. ジストニックおよび多動性ジスキネジア運動の強度(表1)と頻度(表2)を、LID行動の初期発症、ピーク行動、および衰退の段階を含むべきである望ましい時点数で評価します。.
   2. 雄および雌の成体Sprague DawleyまたはFisher 344ラット、およびN = 40ラットのサンプルサイズの場合、最初のL-DOPA注射の20分後にジスキネジア評価を開始し、その後、ラットの90%〜100%でLID行動がいつ中止されたかに応じて、注射後220分または270分まで50分間隔でジスキネジア評価を開始します。
   3. 1分の評価間隔を使用する場合は、タイマーを1分に設定し、最初のラットを1分間評価します。次のラットに移動し、1分間評価します。すべてのラットを1分間隔で評価します。
   4. ケージの隣にタイマーを目視できるように配置して、評価期間中の任意の行動(表2)の頻度を推定しながら、LIDの挙動強度(表1)を観察できるようにします。
   5. 最初の時点の評価が完了した後、次の時点(例:注射後70分)で最初のラットから再開し、すべての時点が完了するまで所望の間隔(例:.、50分ごと)で継続します。
      手記：L-DOPA 注射と LID 評価タスクが重複しているため、評価日には注射と行動評価の 2 人が必要です。

結果

図1:治療タイムラインの例。 例 L-DOPA の用量漸増タイムラインは全長で 12 週間で、8 週間の L-DOPA 注射は 6-OHDA 病変の 3 週間後、実験的治療の 4 週間後に開始されます。この例では、L-DOPA は、処方された L-DOPA 用量 (3、6、9、および 12 mg/kg) ごとに 2 週間、毎日ほぼ同じ時間に週 5 回 (月曜日から金曜日) 皮下注射されます。行動 LID の評価は、各 L-DOPA 投与量レベルの 1 日目、6 日目、および 10 日目に行われます。

図2:大規模ラッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100分デジタルタイマー	ステープル	1111764
コンパス CX コンパクトスケール	オーハウス	30428202
5-(2-アミノエチル)-1,2,4-ベンゼントリオール、臭化水素酸塩	ケイマンケミカルズ	25330	6-OHDAは、げっ歯類のドーパミン作動性病変やパーキンソン病症状を誘発するために使用されるカテコールアミン作動性神経毒です。
アレンタウンケージ	アレンタウン、LLC	ラット900	アレンタウンケージは、ネズミをあらゆる側面から見る能力を提供します。
BDアレルギートレイ(針が恒久的に取り付けられています)	BDの	BDの305540	L-DOPA皮下注射用
塩酸ベンセラジド	シグマ・アルドリッチ	B7283の	ベンセラジドは、PDのげっ歯類モデルでジスキネジアを誘発するためにL-DOPAで使用される末梢デカルボキシラーゼ阻害剤です。
ガラス琥珀色のシンチレーションバイアル	サーモサイエンティフィック	B7921	L-DOPA/ベンセラジドを滅菌生理食塩水と混合するまで-20°Cで保存するために使用されます。
L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	D1507	L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルは、げっ歯類のパーキンソン病症状を治療するために血液脳関門を通過し、使用するL-DOPAの前駆体です。
ペーパーメイトシャープライターシャープペンシル	ステープル	107250
げっ歯類の栄養的に完全な濃縮御馳走	バイオサーブ	F05478
丸型アイスバケツ ふた付き, 2.5 L	コーニング	432129
標準プラスチッククリップボード	ステープル	1227770
スチールワイヤード6フィートロング可動シェルフユニット	ユーライン	H9488-J	幅/高さは、実験ごとにラットの数/数に調整できます
滅菌生理食塩水0.9%	コヴィディエン/アーガイル	1020	L-DOPA/ベンとの混合用

型 名