皮質オルガノイド切片における神経細胞の老化検出

要約

出典:Shaker, M. R., et al. Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro.J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、老化細胞で上昇するβ-ガラクトシダーゼ活性を染色することにより、皮質オルガノイド切片の老化ニューロンを検出する方法を実演しています。この酵素は基質を切断して青色の生成物を生成し、続いて染色されたニューロンを顕微鏡で観察します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 皮質オルガノイドにおける神経細胞老化の解析

1. クライオ切片のための皮質オルガノイドのプロセス:
   注: この手順はクラス2のバイオセーフティフードで行われました。
   1. 2 mLのチューブを調製し、それぞれに1.5 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を充填します。
   2. P1000ピペットチップの端をカットし(幅の広い穴にするため)、各オルガノイドを上記で準備した2 mLチューブのいずれかに静かに移します(チューブごとに1つのオルガノイド)。
      注:分化培地(DM)がPFAと過剰に混ざるのを防ぐため、オルガノイドをP1000ピペットチップの開口部に向かって沈み込ませ、オルガノイドをピペッティングする前に、チップをチューブ内のPFAの上部のすぐ上に置きます。これにより、研究者はオルガノイドと非常に最小限の培地のみを移乗することができます。
   3. 固定プロセスを4°Cで1時間行います。
   4. 未カットのP1000ピペットチップを使用して、余分なPFAを慎重に吸引し、1.5 mLの冷たい1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を加えます。
   5. チューブを70rpmに設定されたオービタルシェーカーに室温(RT)で10分間移します。
   6. 冷間1x PBSで洗浄プロセスを3回繰り返して、すべてのPFAが完全に除去されていることを確認します。
      注:PFAを通常の廃棄物容器に廃棄しないでください。代わりに、PFAは危険であるため、これに対して特定の化学廃棄物処理容器を準備してください。
   7. オルガノイドを30%スクロースを含む1x PBSに浸し、すべてのオルガノイドがチューブの底に沈むまで4°Cでインキュベートします。
      注: オルガノイドが沈むのに必要な時間は、オルガノイドのサイズと年齢によって異なります。生後3ヶ月のオルガノイドは最大5時間かかる場合があります。
   8. カットされたワイドボアP1000ピペットチップを使用して、30%のショ糖と100%の最適切断温度(OCT)培地からなる埋込溶液を含む埋込型に、3〜5個のオルガノイドを3:2の比率で静かに移します。
   9. 10 μLのピペットチップと実体顕微鏡を使用して、オルガノイドを格子状に向き、配置します。
   10. クライオスタットを使用してクライオセクショニング(16-20μm)を進める前に、型をドライアイス上に置いてショ糖OCT溶液を固化させます。
       注: 老化関連β-ガラクトシダーゼの場合、すべての組織が沈んだら切片化のために処理する必要があります。免疫蛍光法では、翌日に組織を切片化するために処理することができます。すぐに染色しない場合は、切片を含むすべてのスライドを-20°Cで保存してから、その後の免疫蛍光法またはβ-ガラクトシダーゼを行ってください。
2. 皮質脳オルガノイドの老化解析プロセス:
   注: 以下の手順は、通常の実験台で実行できます。
   1. スライドを蓋付きの顕微鏡スライド染色容器に移し、切片化したオルガノイド組織を1x PBSでRTで10分間3回洗浄し、余分なマウント溶液を取り除きます。
   2. その後、洗浄した組織を新しく作ったβ-ガラクトシダーゼ染色溶液と37°Cで一晩インキュベートします。
      注: β-ガラクトシダーゼ染色液は、リン酸緩衝液 (リン酸緩衝液 10 mL の場合: 1 M NaH₂PO 8.15 mL 1M NaH{{}}2{{}}PO₄ 1.85 mL 1M Na₂HPO₄) 調整 pH = 6, 100 mM のヘキサシアノバクテリア酸カリウム (III) でできています。 100 mM のヘキサシアノバクテリア酸カリウム (II) 三水和物、5 M の NaCl、1 M の MgCl₂、20 mg/mL の X-Gal。CO₂を含む標準的な細胞培養インキュベーターは、CO₂がβ-ガラクトシダーゼ染色液のpHを変化させるため、使用しないでください。
   3. β-ガラクトシダーゼ溶液を除去するには、染色した組織を1x PBSでRTで10分間、それぞれ3回洗浄します。
   4. 洗浄したティッシュをガラス製の退色防止剤でマウントし、顕微鏡で観察する前に、マウント溶液をRTで30分間固化させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16%ホルムアルデヒド(W / V)メタノールフリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28908	PFAの4%を1x PBSで希釈
SC50カメラ付きCKX53顕微鏡	オリンポス
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	シグマアルドリッチPty株式会社	D1408-500ミリリットル
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	DMメディアで使用
OCT包埋コンパウンド さくらクリア (118mL/ボトル)	ティッシュテック	4583
ヘキサシアノフェレートカリウム(II)三水和物	シグマアルドリッチPty株式会社	CP1087
ヘキサシアノフェレートカリウム(III)	シグマアルドリッチPty株式会社	455946
Prolong Glass 退色防止封入剤	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア(TFS)	P36980
蔗糖	シグマアルドリッチPty株式会社	PHR1001-1G	スクロースの30%を1x PBSで希釈

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