マウスモデルにおけるハンドリング誘発発作

要約

出典:Batot, G., et al.Theilerのマウス脳脊髄炎ウイルスを使用した感染性病因のてんかんのモデル。 J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、Theiler's Mousephalomyelitis Virus(TMEV)に感染したマウスにおけるハンドリング誘発性発作の誘発を示しています。感染したマウスは、過興奮性のニューロンを持ち、外部の物理的刺激にさらされます。この曝露はストレスを引き起こし、ニューロンの異常な電気的活動を引き起こし、発作を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ウイルス接種

1. 注射器の滅菌
   1. インスリン注射器のキャップを外します。針の周りのカラーとしてポリエチレンチューブを追加し、2.5mmの適切な注入深さを確保します。シリンジをエタノールに30分間浸します。シリンジをUVライトの下に30分間置きます。
   2. キャップを針に戻します。シリンジを滅菌ポーチに包み、テープで閉じます。準備の日付でラベルを付けます。
2. ウイルスインジェクション
   1. ダニエルのTMEV株のアリコートを-80°Cの冷凍庫から取り出します。ウイルスを解凍し、氷の上に保ちます。ウイルスの解凍や再凍結は避けてください。シリンジにウイルス懸濁液(20 μLのリン酸緩衝生理食塩水[PBS]またはダルベッコの改変Eagle培地[DMEM]培地で希釈した3 x 10⁵プラーク形成ユニット[PFU])をロードします。
      注意:このウイルスはマウスには感染しますが、人間には感染しません。
   2. ベンチを消毒剤で清掃し、ヒュームアブソーバーの下で作業します。ウイルス接種は無菌ではなく、可能な限り清潔です。
   3. マウスを麻酔導入チャンバーに移し、酸素中の2%イソフルランを使用して麻酔を誘発します。外科的耐性に達するには数分かかります。動物の呼吸と麻酔の深さに基づいて濃度を調整します。
   4. 麻酔をかけたマウスをフードの下の麻酔ボックスから移します。つま先をつまむなどして、外科的耐性を確認します。全処置は30秒未満で行われるため、注射中に動物がイソフルランを吸入する必要はありません。角膜の乾燥を防ぐために目の軟膏を追加します。
   5. アルコールパッドで動物の頭をきれいにします。マウスの頭を少し左に傾けて、注射部位が上を向くようにします。
   6. 皮膚を少し後方に引っ張り、針を頭部に挿入し、右半球の側頭領域(右眼の後部と内側)に2.5mmの深さまで皮質内に20μLを注入します。
   7. 注射は、すべての動物の同じ半球で一方的に行います。目と耳を頭頂皮質の位置の目印として使用します。この配置は以前に組織学的に確認されています。図 1 を参照してください。bregmaに対する定位固定装置注射による注射座標は−2.0(AP)である。+3.0 (ML);−1.5(DV)です。
   8. 注射器を5〜15秒間そのままにし、注射液からの漏れがある場合、または気泡が見られる場合は書き留めます-その場合は、新しい注射器を準備します。シリンジを慎重に引き抜くときは、シリンジを少し回転させてください。麻酔下での乾燥を防ぐために、目の軟膏を塗布します。
   9. オプション:地元の手順に応じて、動物を尻尾または耳にコード化します(オプションですが、動物が意識を失っているため簡単です)。
   10. 動物を新しいケージに移し、麻酔からの回復中に加熱パッド(35-40°C)に半分/半分オフに置きます。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
       手記：動物は回復後に再びグループハウスにすることができます(感染した動物は模擬感染動物と混合されません)。感染したマウスは、感染していないマウスと同じ部屋に収容しないでください。.
   11. 感染後最初の7日間は、感染後に体重が減少し、追加の給餌が必要になる可能性があるため、マウスの体重を追跡します。

2. 取り扱いによる発作のモニタリング

1. この手順は、治療を知らされていない実験者が行います。すべてのケージをベンチに持ってきます。光期には、動物の発作を毎日2回観察します。
2. 修正されたラシーンスケールで発作活動をスコアリングします:0 =行動に変化なし、1 =口と顔の動き、2 =頭のうなずき、3 =片側前肢クローヌス、4 =隆起を伴う両側前肢クローヌス、5 =姿勢緊張の喪失、時々ジャンプする、6 =長期にわたる過度のジャンプと多動性を伴う全身性強直間代活動。発作の回数と強度を報告します。
3. ケージの上でペンをスライドさせて音を立てます。
4. 各動物を別の箱に移して戻します。
5. 動物がケージの側面や上部にぶつかって怪我をする危険があるほどケージを強く振らないように注意しながら、前後の動きでケージを静かに振ってください。
6. ケージ内のすべての動物に発作がないか監視します。いつでも、マウスに発作が起こった場合は、マウスをホームケージに戻して、ノイズや取り扱いによるさらなる発作刺激なしに、発作のレベルを書き留めてください。
7. 自発的に発作しなかった動物や、ケージを軽く振った後に発作を起こした動物は、より激しい取り扱いで発作を引き起こします:マウスの尻尾を左から右にひっくり返して慎重にひっくり返します。
   手記：発作のある動物は過興奮性で、びくびくすることがあります。
8. 各動物に発作行動がないか再度観察します。後続のケージについてもこのプロセスを繰り返します。

結果

図1:TMEV注射手順の概略図 左から右へ:右頭頂皮質注射の場合、針は目と反対側の耳の間の仮想線のわずかに外側に注入されます。深さ制御用のカラーは黄色で示されています。注射管は、矢印でマークされた冠状脳部分に見ることができます。注入部位は、矢印の上にある座標に対応します。右の画像は、海馬形成のCA1内のTheilerウイルス(バイオレット)の分布を示しています。図は biorender.com を使用して作成しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アニマルバランス	オーハウス(アメリカ・ニュージャージー州パーシッパニー)	STX2202	0.01 g〜2200 g
BD Lo-Dose U-100 インスリンシリンジ	BD(カナダ、オンタリオ州ミシサガ)	BD329461	常設BDマイクロファインIV針付きLo-Dose滅菌シリンジ - 1 mL
TMEVのダニエル株	提供:ロバート・フジナミ(ユタ大学)	-	3 x 105プラーク形成ユニットアリコート
消毒剤、例:VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH、 ドイツ	-	キャンパスの獣医師が推奨するアルコール
フィッシャーブランドミディアム滅菌アルコール調製パッドC7	サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)	22-363-750
フルリソ	VETone(アメリカ、アイダホ州ボイシ)	502017	イソフルラン 250 mL、2%–5%
ヒュームアブソーバー	Labconco(米国ミズーリ州カンザスシティ)	-	-
一般的な保護使い捨てSMSホワイトラボコート	サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)	17-100-810A
アイスバケツ	-	-	任意
マウスケージ	-	-	少なくとも5匹のマウスを保持するマウスケージ
PrecisionGlideニードル	BD(カナダ、オンタリオ州ミシサガ)	329652	BDスリップチップ、PrecisionGlideニードルインスリンシリンジ - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
セルフシール滅菌ポーチ	フィッシャーサイエンティフィック(米国ニューヨーク州ハンプトン)	NC9241087	12.6 x 25.5 cm
小さなガラスフラスコ	-	-	任意、容量25 mL
滅菌PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)	10010056
シリンジ Luer-Lok	BD(カナダ、オンタリオ州ミシサガ)	309628	1 mLシリンジのみ
超音波洗浄機、ヒーター/機械式タイマー	コール・パーマー(アメリカ・イリノイ州バーノンヒルズ)	EW-08895から23	バスソニケーター - 0.5ガロン、115V