動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. リソフォスファチジルコリン(LPC)溶液調製
- 25 mgのLPC粉末(材料の表を参照)を250 μLのクロロホルムとメタノールの混合溶液(1:1)に溶解して10%LPC溶液を作り、500 μLの遠心分離チューブに移します
注:LPCが完全に溶解していない場合は、遠心分離管を超音波洗浄機に入れ、40 kHzで~1時間超音波処理して均一な溶液を得ます。
- 溶液を3 μL/チューブに分割し、-80 °C.
で保存します。
注:溶液は~2年間保存できます。
- 手術前に、溶液を27μLの0.9%塩化ナトリウム(NaCl)溶液で希釈し(ステップ1.2)、溶液を37°Cの恒温ウォーターバスに保ちます
注:注入を開始する直前に溶液を準備します。
2. 手術の準備
- 32 G、2インチの針を使用して、5 μLシリンジに接続します(材料の表を参照)。マイクロリットルの注射器が遮られていないことを確認してください。5 μL の LPC 溶液を回収して、注入液を調製します。
- イソフルラン気化器に接続された誘導チャンバーでマウスに麻酔をかけ、3%イソフルランと100%酸素を約0.3L/minの速度で混合します。
- 呼吸がスムーズで、つま先つまみ反射がないことで麻酔の深さを確認します。
- 電気シェーバーを使用して、耳の間のマウスの頭を剃ります。施術中の角膜の乾燥を防ぐために、潤滑性の点眼薬を塗布します。
- 次に、マウスを背側を上にしてマウスを定位固定装置フレーム(材料の表を参照)に配置し、ノーズコーンと歯のクランプで頭を固定します。鼻から1.2%〜1.6%のイソフルランで麻酔を維持します.
手記：イソフルラン濃度は、マウスの呼吸状態に応じて調整することができます。
3. 外科的処置
注:すべての手続き中、動物は加熱パッドの上に置かれます。
- マウスを両側のイヤーバーで定位固定装置に固定します。イヤーバーが水平で、ヘッドが水平で安定していることを確認します。
- 頭の上の皮膚をヨードフォアで数回拭き、続いてアルコールを円を描くように拭いて消毒します。次に、メスを使って頭皮の正中線に沿って約1.5cmの小さな切開部を切開し、頭蓋骨を露出させます。
- 1%過酸化水素に浸した綿棒で頭蓋骨を拭き、ブレグマ、ラムダ、および後部フォンタネルが露出するまで拭きます。シリンジを定位固定装置に置きます.
注意: 過酸化水素は注意して使用し、周囲の組織に触れないようにしてください。
- 動物の頭の水平位置(前後と左右の両方)を確認してください。
- 定位固定装置フレームのZ軸つまみを、針先と頭蓋骨が曲がらずにちょうど触れるように調整し、Z軸の座標を測定します。bregmaとposterior fontanelleのZ座標を確認します。
- ブレグマと後口のZ座標の差が0.02mm以下になるようにイヤーバーを調整します。次に、同じ方法に従って、正中線の左側と右側の対応する位置のZ座標を測定します。イヤーバーを調整して、左右が同じレベルになるようにします。
- 脳梁を見つけます。XYZ原点をbregma.
に設定します
注:最初の注入部位は、ブレグマの外側1.0 mm、深さ2.4 mm、前方1.1 mmです。2 番目の注入部位は、ブレグマの外側 1.0 mm、深さ 2.1 mm、前方 0.6 mm です。たとえば、ブレグマの座標は (0,0,0) です。(-1, 1.1, X) と (-1, 0.6, Y) でマークされた対応する位置の Z 座標を計測します。脳梁の第1の注入部位座標は(−1, 1.1, −[X + 2.4])、第2の注入部位は(−1, 0.6, −[Y + 2.1])であると決定することができる。
- 注射部位が決定したら、頭蓋骨に滅菌マーカーで印をつけ、座標を記録します。
- マークされた部位をスカルドリルで静かにドリルします(材料の表を参照)。出血しないように注意してください。
- 針を所定の座標までゆっくりと動かし、注射を開始します。脳梁の脱髄を誘導するには、各注入部位(ステップ3.5)に2μLのLPC溶液(ステップ1.2)を0.4μL/minの速度で注入します。
- 注射後、針をさらに10分間各部位に保ちます.
注:2回の注射の間隔が20分以内であることを確認してください。
- 4-0縫合糸で皮膚を縫合し、動物が10分以内に目覚めるのを待ちます。施設の動物管理規則に従って術後に鎮痛薬を投与します
注:安楽死の推奨時間は、実験の目的に応じて決定できます。