ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデリング

要約

出典:Miller, B. A., et al. ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデル化。J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、新生児脳室内出血のラットモデルを生成する方法を示します。この手順では、麻酔をかけたラットの子犬にヘモグロビンを脳の側室に注射します。ヘモグロビンは酸化ストレスを引き起こし、ヘムを放出し、脳室内出血をシミュレートします。その結果、活性酸素種と炎症性サイトカインによって引き起こされる脳組織の損傷は、脳室内出血の一般的な結果である心室拡大を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ヘモグロビンおよびCSF溶液の調製

1. 1.5 mLのマイクロチューブに500 μLのaCSF溶液を加えて滅菌人工脳脊髄液(aCSF)溶液を調製し、氷上に保存します。
2. 1.5 mLマイクロチューブ中の500 μLのaCSFに75 mgのヘモグロビンを加えて、滅菌済みの150 mg/mLヘモグロビン溶液を調製し、氷上に保存します。

2.注射のための動物の準備

1. ラットの体温を維持するために、加熱パッドを中型の設定に回します。
2. 3% イソフルランで満たされた導入チャンバーで出生後 4 日目 (P4) ラットに麻酔をかけます.
   手記：15分ごとにつま先/尻尾をつまむ反応を使用して、十分な麻酔を確認します。組織の色、体温、呼吸数を視覚的に観察して麻酔を監視します。
3. 麻酔をかけたラットに5 mg / kgの皮下カルプロフェン注射で鎮痛剤を投与します。.
4. 麻酔をかけたラットを定位装置にうつ伏せにして置き、鼻を麻酔アダプターに配置し、1.5%イソフルランの一定の流れで
配置します。
5. 外耳道の破裂しないイヤーバーを締めて、頭を固定します
   手記： 注射の年齢で目が開いている場合は、目の潤いを保つために獣医軟膏を塗布します。
6. ベタジンと70%エタノールに浸した滅菌綿の先端のアプリケーターと交互に、ヘッドを清掃します。
   1. ベタジンを染み込ませたアプリケーターを頭皮の中央に接触させ、ベタジンを円を描くように広げて外側に移動します。
   2. エタノールを浸したアプリケーターで手順2.6.1.1を繰り返します。
   3. 手順2.6.1.1と手順2.6.1.2を3回繰り返します。
7. 手術野を保護するために滅菌外科用ドレープを適用します。
8. 滅菌メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3cm切開して頭蓋骨のブレグマを露出させます.
   手記：ラムダから注入する場合は、ブレグマの代わりに頭蓋骨のラムダを露出させます。
9. 滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、その領域を乾燥させます。

3. 定位インジェクターの設定

1. ステップ1.2で調製したヘモグロビン溶液を30G針付きの0.3mL滅菌シリンジに引き込み、シリンジを定位注射器システムに入れます
   手記： コントロール条件を生成する場合は、ステップ1.1で調製したCSF溶液を0.3 mLの滅菌シリンジに引き込み、プロトコールを進めます。
2. 定位インジェクターインターフェースをオンにし、[Configuration]ボタンをクリックして、注入量と速度の設定を入力します。
   1. [Volume] をクリックし、容量を 20,000 nL (20 μL) に設定します。
   2. Infusion rateをクリックし、速度を8,000 nL/min(8 μL/min)に設定します。
3. Reset Posボタンをクリックして、Configurationを終了します。
4. ヘモグロビン溶液の小さなビーズが針先に現れるまで、注入ボタンをクリックして針先を洗い流します。
5. 滅菌綿の先端のアプリケーターで針先からヘモグロビン溶液をやさしく吸い取ります。.

4. 動物注射

1. シリンジの中外側と前後の位置を調整して定位インジェクター システムでブレグマをゼロに設定すると、フラッシングされたシリンジ針の先端を下げてブレグマの頭蓋骨に優しく触れます
   手記： ラムダからインジェクションする場合は、ラムダを 0 に設定します。
2. 選択した座標を特定します。
   1. ブレグマから注入する場合は、ここに記載されているP4ラットでは、ブレグマから1.5 mmの横方向、0.4 mmの前方、および2.0 mmの深さを使用します。
   2. ラムダから注入する場合は、P4ラットの座標として、横方向1.1 mm、前方4.6 mm、ラムダから深さ3.3 mmの座標を使用します。
3. シリンジの針を頭蓋骨の1cm上に上げて、頭皮をきれいにします。シリンジが上がったら、中外側座標と前後座標の設定に進みます。
4. シリンジの針を下げて、頭蓋骨にそっと触れます。針が頭蓋骨に触れていることを確認してください。
5. 背腹座標を30秒の周期で設定します.
   手記：背腹側座標をセットしている間、針は頭蓋骨に穴を開けます。注射器が頭蓋骨を変形させずに頭蓋骨を通過するように注意する必要があります。頭蓋骨の変形は、変形が発生した場合に針を背腹側座標に沿ってゆっくりと引き抜き、その後、針を同じ軌道に沿って戻すことで回避されます。これにより、針はより少ない力で頭蓋骨の穴を通過でき、変形することはありません。
6. 定位インジェクターのインターフェースで、「Run」ボタンをクリックして注入を開始します。
7. 注射が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために、シリンジ針を2分間そのままにしておきます。
8. 針先が頭皮の2 cm上に来るまで、背腹側座標に沿って2分以上ゆっくりとシリンジを引き抜きます。.
9. 定位インジェクターアームを手術野から離して回転させます。

5. 術後のケア

1. 6-0モノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。0.3cmの切開部の中央に単純な断続縫合糸を1つ作ります。
2. 子犬を麻酔から外し、加熱パッドの安全な場所に置きます。
3. げっ歯類を家のケージに戻して、ダムの世話の下で麻酔から回復します.
   手記： タイムリーにダムのケアに戻ると、術後の早期死亡率が減少します。
4. 手術後 3 時間ごとに立ち直り反射を失うことにより、動物の麻酔を監視します。
5. 通常の活動、食物摂取、および体重増加について、動物を7日間毎日監視します。切開部位の創傷治癒、閉鎖、手術部位の毛皮の再現を監視します.
   手記： まれに、モニタリング中に発作、中枢性うつ病、食欲減退などの神経学的変化が観察される場合は、麻酔下で血管内灌流または頸部脱臼を使用して動物を安楽死させます。
6. 縫合糸が閉じられ、創傷が治癒した後の感染を防ぐために、切開部位に局所トリプル抗生物質を塗布します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.3 mLインスリン注射器	BDマイクロファイン+インスリンシリンジ	〒230-4533	0.3〜0.5mLのシンリンジが機能します
1.5 mLマイクロチューブ	USAサイエンティフィック	1615-5500	ロット番号 K194642H -3 511
6-0モノフィラメント縫合糸	エチコン	667グラム
分析天びん	CCURISインスツルメンツ	W3200-320
人工CSF(aCSF)	トクリス・バイオサイエンス	3525	バッチ番号:72A
ベタジン	パデュープロダクツLP	301005から00	NDCの67618-150-09
カルプロフェン(注射剤)	株式会社ゾエティス	PIの4019448	リマディル
エタノール	デコン研究所	2701
ヒーティングパッド	サンビーム	E12107-819	UL 612A、Z-1228-001
ヘモグロビン	MPバイオメディカル	100714	ロット番号SR02321
イソフルラン	ピラマル救命救急	NDCの66794-017-25
イソフルラン気化器	ベテキップ	911103
定位装置用のライト	ドーラン・ジェンナー産業	ファイバーライト MI-150
マイクロインジェクションシリンジポンプ	世界の精密機器	MICRO21	シリアル184034 T08K
酸素	エアガスヘルスケア	UN1072	ロットナンバー S1432080XA02
Sprague Dawleyラット	チャールズリバー研究所	ひずみコード:001
定位計測器	KOPFインストゥメント	モデル900LSレイジースーザン
滅菌綿先端アプリケーター	フィッシャーブランド	23-400-118
外科用ブレード	コトラス	#10
局所用トリプル抗生物質	トリプル抗生物質軟膏	NDCの51672-2120-1