トランスジェニックマウスモデルにおける熱誘発性発作の誘発とモニタリング

要約

出典:Das, A., et al.てんかんのマウスモデルにおける熱誘発性発作の行動スクリーニング。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、てんかん関連の遺伝子変異を持つトランスジェニックマウスで、制御されたチャンバー内で体温を徐々に上昇させることにより、熱誘発性発作を誘発する手順を示しています。このプロトコルは、てんかんの発作メカニズムと潜在的な治療法を研究するために使用されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 熱発作アッセイの準備

1. ヒートチャンバーの電源オンボタンをオンにし、次にヒートオンボタンをオンにします。
2. デジタル温度コントローラーのキーパッドを使用して、ヒートチャンバーの温度を50°Cに設定します。
3. チャンバーを50°Cに予熱するために最低1時間待ってから、最初のマウスをチャンバーに導入します。予熱により、チャンバー内の均一な加熱が保証されます。
4. マウスのヒートチャンバーの床に穂軸の寝具を敷きます。
5. ヒートチャンバーの前にビデオ録画カメラを取り付けて、各熱誘発発作アッセイの試行を記録します。
6. 直径140mmのシャーレにティッシュペーパーを厚く敷き詰め、氷の上に置いて冷却パッドとして使用します
   手記：アッセイの最後に、個々のマウスを予冷した冷却パッドに移し、体温の上昇を下げます。

2. マウスの熱誘起発作アッセイの準備

1. 10匹の成体マウス(P30-P40)、てんかんの原因となる突然変異を持つ5匹、および野生型同腹仔5匹を熱誘発性発作スクリーニングアッセイのために選択してください
   手記： てんかんの原因となる突然変異を持たない野生型マウスは、44°C未満の温度で熱誘発性発作を示さず、対照群として機能します。
2. スクリーニングアッセイに使用する各マウスの体重を量り、その体重を記録します。アッセイには、体重15 g以上のマウスのみを使用してください。
3. マウスのヒートチャンバーで一度に1匹のマウスをスクリーニングします。
4. ベルジャーの底に数滴のイソフルランを使用して、マウスに10〜15秒間短時間麻酔をかけます。
5. ベルジャーから動物を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。
6. マウスが有害なつま先のつま先つまみに反応しないことを確認して、マウスが完全に麻酔されていることを確認してください。
7. 直腸温プローブの金属先端に潤滑剤(ワセリンなど)をコーティングし、マウスの深さ2cm以下でそっと挿入します。
8. アッセイ中にプローブが抜けないように、直腸プローブをマウスの尾部にテープで固定します><。 手記：あるいは、動物をマウスの拘束コーンに入れ、直腸温度プローブを挿入します。テールにテープで固定します。
9. 直腸プローブがマウスの内部体温を表示するマルチメーターに接続されていることを確認します。
10. 穂軸の寝具が敷かれた新鮮なケージ、つまり回復ケージに動物を置きます。
11. タイマーを開始し、5分間待ちます。 マウスが麻酔から完全に回復し、マウスがアクティブでグルーミングされるまでマウスを観察します。
    1. 同時に、マウスの深部体温が35〜36°Cで安定するまで監視します。
12. 5分が経過したら、マウスの体温をメモします。これは、時間「0」分
    における初期体温です。 手記：マウスの深部体温が35°C未満の場合は、麻酔による低体温症から回復するまでさらに待ちます。
13. 個々のマウスを予熱したマウスチャンバーにすばやく移します。これが実験トライアルの始まりです。一度にスクリーニングされるマウスは 1 つだけです。

3. 熱誘起発作アッセイ

1. 予熱したマウスヒートチャンバーの床にマウスをそっと置いた後、プレキシガラスのドアを閉め、実験をビデオ録画するためのカメラを起動します。
2. ストップウォッチをスタートします。実験期間中、直腸体温計からマウスの体温を1分間隔で記録します。
3. 一定の間隔で、マウスの体温が0.25〜0.5°C/分の割合で上昇するようにマウスのヒートチャンバーの温度を上げます
   手記：体温の急激な上昇は熱中症や死に至る可能性があるため、避ける必要があります。
4. このプロトコルに従って、図1Aに示すように、マウスのヒートチャンバーの温度を10分ごとに5°C上げます。
5. 9.5分で、ヒートチャンバーの温度を55°Cに設定し、デジタル温度ディスプレイに示されているように、55分までにヒートチャンバーの温度を10°Cに安定させます。
6. 同様に、19.5分で温度を60°Cに上げて、20分までにヒートチャンバーの温度を60°Cに安定させます。各発作スクリーニング試験は30分間続きます。
7. マウスが発作を起こした場合(発声、頭のうなずき、前肢のクローヌス、後肢の伸展、横倒し、または全身性強直/間代性痙攣を経験する)、次の情報を記録してください。
   1. 発作中のマウスの体温(発作閾値温度)を直腸温計から記録します。
   2. マウスに表示される頭のうなずき、前肢のクローヌス、後肢の伸展、横への転倒、および/または全身性強直/間代発作(GTCS)などの発作行動特性を記録します。
8. マウスをチャンバーからすばやく、しかしそっと持ち上げ、手順1.6.
   で準備した冷却パッドに置きます 手記：マウスがラシーンスケール5の発作を起こし、制御不能な跳躍を示している場合、動物をヒートチャンバーからピックアップして外部の冷却パッドに移すのが難しい場合があります。しかし、典型的な熱誘発性発作は30秒から60秒の間持続します.したがって、マウスは熱室から取り出し、熱誘発性発作エピソードの開始から60秒以内に冷却パッドに置く必要があります。
9. マウスの体温が36〜37°Cに下がるのを待ってから、回復ケージに移します。リカバリーケージには一度に1匹のマウスしか入れられません。
   手記： まだ熱誘起スクリーニングに使用していないマウスと、すでに熱誘起発作実験の試験を経験したマウスを混ぜないでください。
10. マウスの尾と直腸プローブワイヤーの間のテープをハサミで優しく慎重に切り、マウスから直腸プローブを取り外します。
11. 直腸プローブの金属先端を70%アルコールと軟部組織ワイプで拭き取り、次の試験に備えます。
12. マウスをホームケージに戻す前に、通常の活動(歩行、グルーミングなど)が再開するまで、回復ケージ内のマウスを観察し続けます。これで、このマウスの実験は終了です。
13. アッセイ後の動物の状態を記録します-生きていて、テストセッションから回復したか、または死亡しました。制御不能な跳躍を伴う高強度の発作や全身性強直性/間代性発作は、マウスの死につながることがあります。
14. マウスが30分間の観察期間内に熱誘発性発作を経験しない場合、またはマウスの体温が44°Cに達する場合は、マウスをヒートチャンバーから取り出し、マウスの体温が36〜37°Cに戻るまで冷却パッドに置きます。
15. マウスのヒートチャンバーの温度を50°Cにリセットし、デジタル温度コントローラーの表示温度が50°Cを示すまで平衡化させます。
16. 個々のマウスの試行間で穂軸の寝具を変更します。

結果

図1:変異マウスは熱誘発性発作を示します。(A)マウスの熱誘発性発作の行動スクリーニングのための加熱プロトコル。(B-C)野生型(Scn1a+/+ -黒色の三角形)とヘテロ接合型変異体(Scn1aKT/+ -オレンジ色の円)マウスの経時平均体温を、それぞれ129X1とB6Nの2つの遺伝的背景で測定しました。(D)両方の遺伝的背景で熱誘発性発作を示したマウスの割合。野生型マウス(Scn1a+/+)とヘテロ接合型マウス(Scn1aKT/+)は、それぞれ黒色とオレンジ色のバーで表されます。129X1およびB6N背景のヘテロ接合性変異体は、それぞれオレンジ色の実線バーと黒色のストライプのオレンジ色のバーで示されています。(

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
軸流ファン	ファーナム	AF20-200-120-xx10-3.1	Farnamカスタム製品 -ファン付き軸流ファンヒーター
デジタル温度コントローラー	インクバード	ITC-100RH	Inkbird デジタルPID温度コントローラー ITC-100RH K熱電対付
マウス直腸温プローブ	サーモワークス、ブレインツリー・サイエンティフィック社	RET-3	体温計付きマウス直腸温プローブ