ラット海馬切片における介在ニューロンの免疫染色

要約

Swietek, B., et al., 神経化学マーカーのためのバイオシチン充填および処理切片の免疫染色. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、ラットの海馬切片でビオシチンを充填した介在ニューロンを可視化するプロセスを示し、特異的抗体と蛍光顕微鏡を使用してその神経化学的同一性を強調しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 一次抗体とバイオシチンの染色

(1日目)
注:以下の免疫染色手順は、フリーフローティング切片用であり、すべてのインキュベーションステップでシェーカー上で低速(2回転/分、rpm)で連続的に振とうする必要があります。

1. 組織を0.1 M PBS(pH = 7.4).
   で各10分間3回洗浄します。 注:0.1 M PBSは、次のように市販または実験室で製造できます（1 Lを製造）:8 gのNaCl、0.2 gのKCl、1.44 gのNa₂HPO₄、および0.24 gのKH₂PO₄を1 LのdH₂O.
   手記：目的の神経化学マーカーがわかっている場合は、バイオサイトチン染色と同時にタンパク質/ペプチドの染色を行うことができます(ステップ1.2 - 1.4)。バイオシチンのみの染色を行う場合は、ステップ1.5に進みます。
2. オプション:10%ブロッキング血清(BS;正常なヤギ血清(NGS)をPBS中の0.3%Triton X-100で希釈し、RTで1時間)でブロックします).
   手記：各ウェルは同じ量の溶液を受け取る必要があります。推奨容量は250〜500μL/ウェルです。ブロッキング血清の選択は、二次抗体が産生される種に基づいています(例:.、NGSは色素標識ヤギ抗(それぞれの一次抗体種)に使用されます)。異なる動物種で産生した二次抗体を使用して切片を免疫染色する必要がある場合は、ブロッキングステップ(2)に各正常血清の10%を、一次抗体および二次抗体のインキュベーションステップに各正常血清の3%を含めます。
3. (オプション)一次抗体CB₁R(ポリクローナル、モルモット)の切片を0.3% Triton X-100および3% BSと0.1 M PBS中のRT O / Nでインキュベートします。CB₁Rは、カンナビノイド受容体1型発現の同定に使用されます
   手記：このステップはオプションであり、バイオサイトン充填を明らかにするために必須ではありません。図 2 は、最初の染色プロセスでビオシチンと CB₁R を標識した切片を示しています。RTでのO/Nインキュベーションは、ほとんどの一次抗体に十分です。ただし、CB₁Rを含む特定の一次抗体は、3〜5 dのインキュベーションを必要とします。インキュベーションを1 dより長くする必要がある場合は、Triton X-100がスライスを透過化し、室温での長時間のインキュベーション中に組織の崩壊を引き起こす可能性があるため、4°Cでインキュベートすることをお勧めします。一次抗体を欠くネガティブコントロールを、二次抗体の特異性のコントロールとして、各一連の実験の少なくとも1つのセクションに含めます。ネガティブコントロールの場合、一次抗体は省略されますが、0.1 M PBSおよびBS中の0.3% Triton X-100が添加されます。

(2日目)

4. 脳切片を0.1M PBS(pH = 7.4)でそれぞれ10分間3回洗浄します。
5. ストレプトアビジン赤色色素コンジュゲート(濃度:1:1,000、励起:594 nm、可視赤色スペクトルで発光)中の切片を、0.3% Triton X-100および3% BS含有0.1 M PBSでインキュベートし、4°C O/Nの暗所(アルミホイルで包まれている)でインキュベートし、バイオシチンを明らかにします。随意： 二次抗体であるヤギ抗モルモット(濃度:1:500、励起:488 nm、発光は緑色)を含め、上記のインキュベーションはステップ1.3.
   の任意の一次インキュベーションに続いて行います 手記： 二次抗体が必要になるのは、オプションの一次抗体染色(ステップ1.3)が行われる場合のみです。ビオシチンを可視化するには、発光スペクトルが赤色のストレプトアビジン-フルオロフォア結合体が推奨されます。これは、より微細な軸索を詳細に可視化し、コントラストを向上させるのに役立ちます(図1 - 3)。

(3日目)

6. 脳切片を0.1 M PBS(pH = 7.4)で各10分間3回洗浄します。
7. 蛍光を保護し、将来の再染色を容易にするために、切片を水性ベースの封入剤にセットし、カバーガラスの端を透明なマニキュアでシールします><。 手記： スライドからのマニキュアの除去の困難さ、カビの侵入、スライドガラスからの封入剤の漏れによる組織の脱水を避けるために、できるだけ早く切片を塗り直すことが最善です。PBSに0.02%アジ化ナトリウムを使用することで、微生物汚染を防ぐことができます.
   注意：アジ化ナトリウムは、水と接触すると非常に有毒で可燃性です。有害化学物質の取り扱いと廃棄については、標準操作手順を参照してください。
   (4日目 - 7日目)
8. 594 nmおよび488 nmおよび20倍または40倍の倍率で励起して共焦点イメージングを実行すると、バイオシチンで満たされたニューロンが赤で、神経化学マーカー(CB₁R)が緑で明らかになります。共同ラベル付けを評価します(図2)。
9. カメラの露出を100ミリ秒未満に設定して、光退色を回避し、ニューロン全体の軸索および樹状突起の共焦点画像スタックを取得します。共焦点画像スタックとニューロントレースソフトウェアパッケージを使用して、ニューロンの形態を再構築します。

結果

図 1.バイオサイトン充填のための細胞へのアプローチのための推奨平面。この画像は、記録中にバイオサイトンで満たされた顆粒細胞(GC)を、バイオサイトン(594標識ストレプトアビジンを使用した赤)に処理したものです。GCの樹状突起はXY平面に向けられています。XY平面に沿ったピペットの動きにより切断された顆粒細胞軸索(緑色の矢印)に注目してください。このニューロンはXZ平面に沿ってアプローチするのが理想的であることに注意してください。スケールバー:50μm

図 2.バイオシチン染色およびカンナビノイド受容体1型CB

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	シグマ	S7653	免疫染色
KCL	フルカ	60129	免疫染色
リン酸水素二ナトリウム	シグマ	S7907	免疫染色
リン酸一カリウム	シグマ	229806	免疫染色
トリトンX-100	シグマ	T8787	免疫染色
モルモット アンチCB1	シグマ	AF530-1	免疫染色
ストレプトアビジン、Alexa Fluorコンジュゲート	分子プローブ	S11227	免疫染色
通常のヤギ血清	シグマ	G9023	免疫染色
ベクタシールド	ベクターラボ	H-1000	免疫染色
二次抗体	Invitogen 分子プローブ	Alexa Fluor標識色素	免疫染色
Labnet軌道低速シェーカー	バイオエクスプレス	S-2030-LS	免疫染色
鉗子	デュモン	11231-30	免疫染色
スライドフォルダ	EMS	71520	免疫染色
ビオシチン	シグマ	B4261	電気生理学